Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample
JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 3:40 мин • July 1st, 2026
Take epithelial cell monolayers. Add diluted supernatants from a virus-infected mouse tissue homogenate.
Incubate for viral adsorption, then wash.
Cover the cells with agar-containing medium, forming a semisolid overlay, and incubate.
The virus enters cells, replicates, and lyses them, releasing new viruses.
The solidified agar restricts viral spread, forming clear zones called plaques.
Remove the overlay. Treat with a fixative to inactivate viruses.
Add a permeabilization buffer to disrupt cell membranes.
Add a blocking buffer to prevent non-specific interactions.
Add primary antibodies. Incubate to allow their interactions with viral nucleocapsid proteins.
Wash and add biotin-conjugated secondary antibodies that bind to the primary antibodies.
Rinse and introduce avidin-biotin-peroxidase complexes, which bind to biotin on the secondary antibodies.
Add chromogenic substrates that react with peroxidase to produce brown precipitates, which stain the plaques.
Count the plaques at different dilutions to quantify the viral load in the tissue sample.
Utilizing the supernatant obtained from the tissue homogenates, perform tenfold serial dilution and infect confluent monolayers of Vero E6 cells with one milliliter of each supernatant dilution in triplicates.
Let the virus adsorb for one hour at 37 degrees Celsius in a humidified 5% carbon dioxide incubator. Once done, wash the cells with one milliliter of 1X PBS and then incubate the cells in two milliliters of post-infection media containing 1% agar in the humidified 5% carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius for 72 hours. After the incubation, inactivate the plates in 10% neutral buffered formalin for 24 hours at four degrees Celsius, ensuring the entire plate is submerged.
Take plates out of biosafety level three and wash the cells three times with one milliliter of 0.5% Triton X-100 for 10 minutes at room temperature. Next, block the permeabilized cells with one milliliter of 2.5 bovine serum albumin or BSA and PBS for one hour at 37 degrees Celsius, followed by incubation in one milliliter of one microgram per milliliter of the SARS-CoV nucleocapsid protein cross-reactive monoclonal antibody 1C7C7 diluted in 2.5 BSA for one hour at 37 degrees Celsius. Wash the cells three times with one milliliter of 1X PBS and develop the plaques using the ABC and diaminobenzene, or DAB, peroxidase substrate kits according to the manufacturer's instructions, then calculate the viral titers as plaque forming units per milliliter.
Обзор
В данной статье подробно описан протокол количественного определения инфекционной вирусной нагрузки SARS-CoV-2 в образцах тканей трансгенных мышей K18 hACE2 с помощью метода определения количества бляшек. Метод заключается в заражении монослоев эпителиальных клеток супернатантами гомогенатов тканей с последующим иммуноокрашиванием и подсчетом бляшек для определения титра вируса.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Вирусология
- Исследование инфекционных заболеваний
- Количественные вирусные анализы
Введение
- Точный количественный анализ инфекционного вируса в тканях имеет важное значение для оценки патогенеза вирусной инфекции и эффективности терапевтических вмешательств.
- Метод анализа по определению бляшек является золотым стандартом измерения количества инфекционных вирусных частиц.
- Трансгенные мыши K18 hACE2 широко используются в качестве модели для изучения инфекции SARS-CoV-2.
- Иммуноокрашивание улучшает визуализацию и специфичность определения бляшек.
Цель исследования
- Предоставить детальный протокол для количественной оценки инфекции SARS-CoV-2 в тканях мыши.
- Обеспечить воспроизводимое измерение вирусных титров с помощью метода анализа бляшек и иммуноокрашивания.
- Способствовать изучению патогенеза вируса и эффективности терапевтических вмешательств на трансгенных моделях мышей.
Используемые методы
- Приготовление гомогенатов тканей вирус-инфицированных мышей.
- Десятикратное серийное разведение супернатантов и заражение монослоев клеток Vero E6.
- Инкубация с агарозным покрытием для ограничения распространения вируса и формирования бляшек.
- Фиксация, пермеабилизация и блокировка клеток.
- Иммуноокрашивание с использованием первичных и конъюгированных с биотином вторичных антител к нуклеокапсидному белку вируса.
- Визуализация с помощью авидин-биотин-пероксидазного комплекса и хромогенного субстрата (DAB).
- Подсчет бляшек и расчет титров вируса в бляшкообразующих единицах на миллилитр.
Основные результаты
- В инфицированных монослоях клеток образуются четкие, поддающиеся подсчету бляшки.
- Иммуноокрашивание с использованием антител к нуклеокапсиду облегчает обнаружение бляшек.
- Титры вируса могут быть точно количественно определены в образцах тканей.
- Протокол воспроизводим и подходит для работы в лабораториях с высоким уровнем биологической безопасности.
Выводы
- Описанный протокол метода определения количества бляшек позволяет точно количественно определить содержание инфекционного SARS-CoV-2 в тканях мыши.
- Иммуноокрашивание повышает специфичность и четкость визуализации бляшек.
- Данный метод обеспечивает надежную оценку вирусной инфекции и исследований терапевтического воздействия на трансгенных моделях мышей.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Количественное определение вирусной нагрузки в инфицированных тканях мыши с помощью метода определения бляшек (plaque assay) является «золотым стандартом» количественного анализа инфекционного вируса, что обеспечивает надежную валидацию мишеней и снижение рисков при изучении механизмов в рамках исследований и разработок (R&D) противовирусных препаратов. Данный метод позволяет точно измерить репликацию вируса и эффективность терапевтического вмешательства, что служит основой для принятия решений на этапах раннего поиска и доклинических исследований. Его воспроизводимость и специфичность имеют решающее значение для приоритизации портфеля препаратов и обеспечения преемственности трансляционных исследований в рамках разработки средств для лечения инфекционных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях&D
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Позволяет количественно проверять антивирусные гипотезы на релевантных моделях мышей с соответствующими заболеваниями.
- Обеспечивает функциональную валидацию вирусных мишеней путем измерения выхода инфекционных частиц.
- Снижает механистические риски за счет разграничения инфекционных и неинфекционных вирусных частиц.
- Повышает прогностическую уверенность в эффективности взаимодействия с мишенью и воздействии вмешательств.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные количественные показатели вирусной нагрузки для последующих этапов скрининга.
- Стандартизирует условия анализа для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости результатов между различными исследованиями.
- Обеспечивает масштабируемость и повторное использование платформы для оценки соединений в условиях высокого уровня биологической безопасности.
- Поддерживает надежную разработку анализа за счет детекции бляшек, усиленной иммуноокрашиванием.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным моделям in vivo для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации противовирусной эффективности.
- Снижает риски при принятии решений о дальнейшем продвижении исследований за счет получения количественных показателей инфекционности.
- Способствует механистическому пониманию патогенеза вируса в модельных системах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол метода анализа бляшек охватывает все этапы — от первичных открытий до доклинических исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез, скрининга и трансляционной валидации в рамках разработки методов борьбы с инфекционными заболеваниями.
- Поисковая биология: Количественная оценка выхода инфекционного вируса для проверки гипотез и снижения биологических рисков.
- Скрининг: Обеспечение воспроизводимых количественных результатов анализа для оценки соединений.
- Аналитика: Возможность статистического сравнения вирусной нагрузки при различных экспериментальных условиях и воздействиях.
- Трансляционные исследования: Связующее звено между данными in vitro и in vivo для согласования биомаркеров и показателей эффективности.
- Корпоративное повторное использование: Предоставление стандартизированной, многократно используемой платформы для количественного определения инфекционного вируса в рамках различных программ.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Обеспечивает прогностическую достоверность и валидацию мишени посредством количественных показателей инфекционности.
- Операционная ценность: Гарантирует стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализа в лабораториях с высоким уровнем биологической защиты.
- Стратегическая ценность: Служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки и снижает биологические риски на поздних этапах формирования портфеля противовирусных препаратов.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение кандидатов в противовирусные препараты.
Рекомендации по внедрению
- Требуются экспертные знания в области вирусологии и опыт работы с процедурами в условиях высокого уровня биологической безопасности (BSL-3).
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для культивирования клеток, иммуноокрашивания и визуализации бляшек.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Может потребоваться адаптация для различных штаммов вирусов или типов тканей, предусмотренная протоколом.
- Практические ограничения включают требования к биобезопасности и ограничения пропускной способности, характерные для ручного подсчета бляшек.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Заторможенность вирусов простого герпеса
Похожие видео
0 Просмотры
Использование кристаллической фиалки для улучшения визуального цитопатического эффекта для титрования вируса с использованием анализов TCID50
Похожие видео
0 Просмотры
Размножение вирусов и клеточная колориметрическая количественная оценка
Похожие видео
0 Просмотры
Пройдя Host-вирус Взаимодействие в Литические репликации Модель Herpesvirus
Похожие видео
0 Просмотры
Измерение γHV68 инфекции у мышей
Похожие видео
0 Просмотры
Бляшек на мышиной норовирус
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ вирусных бляшек: метод измерения инфекционного вируса простого герпеса путем количественной оценки бляшек, образующихся в монослое инфицированных вирусом клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Определение противовирусной эффективности экспериментальных препаратов с помощью анализа бляшек
Похожие видео
0 Просмотры
Определение концентрации вируса через бляшки Анализы: используя традиционные и новейшие системы Наложение
Похожие видео
0 Просмотры
Исследования вирусов гриппа A в мышиной модели инфекции
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026