Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 2:22 мин. • August 31st, 2026
Начните с культурального флакона, содержащего клетки эмбриональной почки человека в богатой питательной среде.
Замените среду на свежую среду, содержащую хлорохин, для усиления доставки плазмид в клетки.
Смешайте плазмиды, кодирующие поверхностные белки гриппа, основные белки лентивируса и геном лентивируса, с фосфатом кальция. Инкубируйте смесь для формирования комплексов фосфата кальция с ДНК.
Добавьте смесь к клеткам и аккуратно перемешайте. Инкубируйте для обеспечения проникновения комплекса в клетки посредством эндоцитоза. Хлорохин способствует выходу плазмидной ДНК из эндосом.
Внутри клетки плазмидная ДНК обеспечивает экспрессию компонентов как вируса гриппа, так и лентивируса.
Замените среду, чтобы удалить избыточные комплексы.
Инкубируйте для обеспечения сборки вирусных компонентов и почкования псевдовирусов, которые высвобождаются в культуральную среду.
Соберите среду, содержащую псевдовирусы, и центрифугируйте ее для осаждения клеточного дебриса.
Соберите супернатант, содержащий псевдовирус, и храните его при низких температурах для последующих анализов.
Для начала приготовьте суспензию одиночных клеток HEK 293FT в полной среде DMEM. Добавьте десять миллилитров суспензии одиночных клеток в флакон T75, затем инкубируйте при температуре 37 °C.
За два часа до трансфекции замените старую среду на десять миллилитров свежей полной среды с хлорохином. Смешайте реагенты и плазмидную ДНК, как описано в статье. Затем перенесите эту смесь в среду поверх клеток и осторожно покачайте флакон.
После инкубации замените среду на 15 mL свежей полной среды DMEM. Через 65 ч соберите супернатант путем центрифугирования. Соберите супернатант и разлейте его по аликвотам.