Подготовка криосрезов сетчатки мыши для оценки проницаемости сетчатки для аденоассоциированного вируса

Возьмите глаз, полученный от мышиной модели с нарушением ретинального барьера, которой предварительно ввели аденоассоциированный вирус, несущий ген зеленого флуоресцентного белка.

Нарушение ретинального барьера позволяет AAV проникать в фоторецепторные клетки, где вирусный геном экспрессируется с выработкой GFP, что делает клетки флуоресцентными.

Проведите диссекцию глаза, чтобы удалить роговицу и хрусталик, сохранив при этом глазное яблоко в целости.

Погрузите глазное яблоко (без роговицы и хрусталика) в фиксирующий раствор для сохранения структуры сетчатки.

Последовательно переносите глазную чашечку в растворы криопротектора с возрастающей концентрацией. Затем инкубируйте в растворе максимальной концентрации для предотвращения образования кристаллов льда.

Залейте глазную чашечку криосредством и заморозьте ее.

С помощью криостата сделайте тонкие срезы глазного яблока.

Закрепите срез на предметном стекле. Добавьте буфер, содержащий детергенты, для пермеабилизации ткани, чтобы обеспечить доступ антител в ходе последующего иммуноокрашивания.

Промойте срез. Обработайте его блокирующим раствором для предотвращения неспецифического взаимодействия антител во время иммуноокрашивания.

Криосрез сетч