Подготовка криосрезов сетчатки мыши для оценки проницаемости сетчатки для аденоассоциированного вируса

Возьмите глаз, полученный от мышиной модели с нарушением ретинального барьера, которой предварительно ввели аденоассоциированный вирус, несущий ген зеленого флуоресцентного белка.

Нарушение ретинального барьера позволяет AAV проникать в фоторецепторные клетки, где вирусный геном экспрессируется с выработкой GFP, что делает клетки флуоресцентными.

Проведите диссекцию глаза, чтобы удалить роговицу и хрусталик, сохранив при этом глазное яблоко в целости.

Погрузите глазное яблоко (без роговицы и хрусталика) в фиксирующий раствор для сохранения структуры сетчатки.

Последовательно переносите глазную чашечку в растворы криопротектора с возрастающей концентрацией. Затем инкубируйте в растворе максимальной концентрации для предотвращения образования кристаллов льда.

Залейте глазную чашечку криосредством и заморозьте ее.

С помощью криостата сделайте тонкие срезы глазного яблока.

Закрепите срез на предметном стекле. Добавьте буфер, содержащий детергенты, для пермеабилизации ткани, чтобы обеспечить доступ антител в ходе последующего иммуноокрашивания.

Промойте срез. Обработайте его блокирующим раствором для предотвращения неспецифического взаимодействия антител во время иммуноокрашивания.

Криосрез сетчатки готов к последующим процедурам иммуноокрашивания и флуоресцентной визуализации. GFP-положительные флуоресцентные клетки свидетельствуют об успешной вирусной трансдукции, что указывает на проницаемость сетчатки.

После извлечения глаз из эвтаназированного инъецированного животного проведите диссекцию глаз для удаления хрусталика и роговицы. Затем подвергните препарированный глаз иммерсионной фиксации в 4% параформальдегиде в течение одного часа. Через час проведите криопротекцию глаз в 10% сахарозе в течение еще одного часа при комнатной температуре. Затем выдержите глаза в 20% сахарозе в течение двадцати минут при комнатной температуре.

В завершение оставьте глаза в 30% растворе сахарозы на ночь при температуре 4 °C. На следующий день заморозьте глазные чашки, залив их в смолу для заморозки, например Cryo-matrix. Затем с помощью криостата сделайте срезы толщиной 10 µm и закрепите их на предметных стеклах, предназначенных для замороженных тканей.

Теперь пермеабилизируйте срезы на предметных стеклах с помощью детергента в течение пяти минут. Затем проведите две краткие промывки в PBS. После этого блокируйте образцы глаз в течение одного часа при комнатной температуре.