Доставка генов с помощью AAV для визуализации нарушения целостности ретинальных мембран

Начните с глаза трансгенной мыши, которой ранее был введен аденоассоциированный вирус (AAV), несущий интересующий ген, кодирующий флуоресцентный белок.

У данной мыши отсутствует ген, необходимый для поддержания целостности внутренней пограничной мембраны (ILM) — барьера, отделяющего сетчатку от стекловидной полости.

Потеря этого гена имитирует ретинальную дегенерацию, что позволяет вирусу проникать глубже в слои клеток сетчатки.

Инфицированные клетки сетчатки экспрессируют интересующий ген, вырабатывая флуоресцентные белки, что позволяет им флуоресцировать.

Теперь препарируйте глаз, удалив роговицу и хрусталик.

Осторожно отделите сетчатку от ретинального пигментного эпителия (RPE) и склеры — внешнего слоя глаза.

Погрузите ткань в фиксатор.

Промойте фосфатным буфером для удаления остатков фиксатора.

При наблюдении под конфокальным микроскопом флуоресценция в клетках сетчатки указывает на успешное проникновение вируса через поврежденную внутреннюю пограничную мембрану.

Для подготовки плоских препаратов сетчатки облегчите диссекцию, фиксируя энуклеированные глаза в 4% параформальдегиде в течение 15–30 минут. Данная фиксация, а также последующая фиксация после диссекции должны быть проведены надлежащим образом, так как это критически важно для сохранения флуоресценции GFP. В течение 15–30 минут периода фиксации проведите диссекцию глаз, удалив роговицу и хрусталик.

Отделите сетчатку от ретинального пигментного эпителия и склеры, разрезя ткани вокруг ora serrata и зрительного нерва. После диссекции погрузите сетчатки в 4% параформальдегид еще на 30 минут для фиксации ткани и флуоресцентного белка в трансдуцированных клетках сетчатки. После фиксации промойте образец в течение пяти минут в стерильном PBS при pH 7.4.