Визуализация подвергнутых термической обработке вирусных капсидов с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Возьмите пробирки, содержащие вирусные капсиды, которые представляют собой вирусоподобные частицы без генетического материала.

Нагревайте пробирки при постоянной температуре в течение разного времени.

Более короткое время нагрева вызывает умеренный стресс белков капсида, в то время как длительный нагрев разрушает капсид и приводит к агрегации.

Быстро охладите пробирки, чтобы предотвратить дальнейшие структурные изменения.

Перенесите жидкость на парафиновую пленку.

Поместите сеточку для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на каплю. Капсиды прикрепляются к поверхности сеточки.

Промокните сетку фильтровальной бумагой, чтобы удалить излишки жидкости.

Промойте буфером, чтобы удалить слабосвязанные капсиды, затем снова промокните сетку.

Погрузите в уранил-ацетат — краситель на основе тяжелого металла, который связывается с поверхностью капсида, благодаря чему те выглядят темнее при ПЭМ.

Промокните сетку и поместите ее на пластину. Храните пластину в эксикаторе для удаления влаги.

Выполните визуализацию сетки с помощью ПЭМ для анализа повреждений капсида, вызванных воздействием тепла.

Проведите термическую обработку, как описано ранее, за исключением того, что вместо 10 мМ HEPES (pH 7.4) используйте PBS, и не разбавляйте капсиды после обработки. Затем перенесите всю каплю 15 µL раствора обработанных капсидов на парафиновую пленку. Захватите край сетки пинцетом, зафиксировав его, и поместите сетку углеродной стороной вниз на каплю обработанного раствора.

Инкубируйте сетку в течение 10 минут, чтобы капсиды успели прикрепиться к ней. В зависимости от чистоты препарата капсидов, при необходимости добавьте промывочный раствор HEPES в виде капель объемом от 10 до 15 µL, расположенных в ряд после капли с обработанным капсидом. Через 10 минут подберите сетку вместе с каплей.

Приложите сетку почти перпендикулярно к кусочку фильтровальной бумаги, чтобы удалить каплю. Затем с помощью сетки подберите каплю 10–15 µL буфера HEPES и выдержите ее в течение 30 секунд. По истечении 30 секунд промывки удалите остатки раствора другим кусочком фильтровальной бумаги.

Затем нанесите каплю 2% раствора уранилацетата объемом 15 µL на свободный участок парафиновой пленки. Поднимите каплю уранилацетата сеткой и выдержите ее в течение 45 с. Затем удалите уранилацетат с помощью фильтровальной бумаги, стараясь убрать большую часть раствора.

Поместите сетку углеродной стороной вверх на кусочек фильтровальной бумаги, стараясь, чтобы сетка не прилипла к влаге на пинцете. Затем поместите фильтровальную бумагу с сеткой в открытую стеклянную чашку Петри. Повторив этот процесс для всех вариантов обработки, поместите половинки чашек Петри с сетками в эксикатор на ночь для высушивания перед наблюдением с помощью TEM.