Доставка генов в спирохетные бактерии с помощью бактериофагов

Возьмите культуру генетически модифицированных бактерий-спирохет. Эти бактерии несут ген устойчивости к гентамицину.

Добавьте суспензию бактериофага в бактериальную культуру.

Фаги несут плазмидную ДНК, кодирующую ген устойчивости к канамицину.

Проинкубируйте смесь.

Бактериофаг прикрепляется к поверхности бактерии и впрыскивает ДНК в клетку.

Плазмида реплицируется независимо и передается при делении бактерий.

Смешайте инкубированную культуру с расплавленной агарозной средой, дополненной антибиотиками гентамицином и канамицином.

Вылейте смесь в чашку. Дайте ей застыть, после чего поместите в инкубатор.

При селекции с использованием двух антибиотиков растут и образуют колонии только те клетки, которые несут оба маркера устойчивости, в то время как остальные клетки погибают.

Выберите колонию и инокулируйте ее в среду, содержащую оба антибиотика.

Проведите инкубацию для стимуляции роста бактерий с трансдуцированной плазмидой для последующего анализа.

Слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в 14,5 мл свежей среды BSK. Добавьте не более 500 мкл образца фага, осажденного PEG, в культуру клона-реципиента.

После тщательного перемешивания инкубируйте при 33 °C в течение 72–96 часов. Проведите отбор трансдуцированных клеток путем посева на плотные питательные среды после смешивания с осажденными ПЭГ фагами, как описано в рукописи. В зависимости от особенностей реципиентного клона убедитесь, что колонии появились внутри агарозы на селективных планшетах после 10–21 дней инкубации.

С помощью стерильной боросиликатной пипетки длиной 5,75 дюйма с хлопковым пробком выберите не менее 5–10 колоний, выросших на чашке в присутствии обоих антибиотиков, и инокулируйте их в 1,5 milliliters среды BSK с соответствующим антибиотиком.