JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 2:40 мин • August 31st, 2026
Возьмите культуры клеток рака молочной железы.
Проведите совместное заражение двумя типами аденовирусов. Один из них несет ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) под управлением конститутивно активного промотора.
Другой содержит репортерный ген, кодирующий красный флуоресцентный белок (RFP), под управлением SMAD-зависимого промотора.
В опытную культуру добавьте TGF-beta и инкубируйте.
Вирусы связываются с рецептором для проникновения в клетку-хозяина, доставляют гены в ядро и обеспечивают экспрессию GFP.
В исследуемых клетках TGF-beta связывается со своим рецептором и активирует путь SMAD путем фосфорилирования белков SMAD2 и SMAD3.
Эти белки образуют комплекс с SMAD4.
Этот комплекс связывается с промотором репортерного гена, обеспечивая экспрессию RFP в дополнение к GFP.
В контроле путь SMAD остается неактивным, что позволяет клеткам экспрессировать только GFP.
Снимите флуоресцентные изображения живых клеток.
Наличие обоих сигналов подтверждает активацию пути SMAD при использовании двойной аденовирусной трансдукции.
В день инфицирования аденовирусом посейте в лунки 12-луночного планшета примерно 1,25 × 10⁵ клеток MDA-MB-231 в 500 мкл среды для достижения конфлюэнтности 35%. Инфицируйте клетки во всех лунках, добавив 75 мкл аденовирусного вектора Ad-CMV-GFP и 7,5 мкл аденовирусного вектора Ad-CAGA12-Td-Tomato для обеспечения кратности заражения (MOI) 2 500, что позволяет достичь 100% положительного результата инфицирования. Затем сразу после инфицирования аденовирусом добавьте TGF-β в лунку для обработки.
Инкубируйте при 37 °C с 10% carbon dioxide в течение 24 часов. На следующий день проведите визуализацию живых клеток с помощью фазово-контрастного флуоресцентного микроскопа.