Мультиплексная флуоресцентная визуализация вирусных нуклеиновых кислот и белков в инфицированных лимфоцитах человека

Начните с лимфоцитов человека, инфицированных HIV-1, на покровном стекле, закрепленном на предметном стекле.

Эти клетки были гибридизированы с зондами, которые флуоресцентно метят вирусную РНК и провирусную ДНК.

Инкубируйте клетки в блокирующем растворе для предотвращения неспецифического связывания антител.

Добавьте первичные антитела к капсидному белку HIV-1.

Инкубируйте образец, чтобы первичные антитела связались с белком капсида.

Промойте клетки буфером, чтобы удалить несвязавшиеся антитела.

Добавьте вторичные антитела с флуоресцентной меткой, которые связываются с первичными антителами.

Отмойте несвязанные антитела.

Добавьте специфический краситель для ДНК, чтобы окрасить ядра клеток, затем промойте образец для удаления избытка красителя.

Используйте мультиплексную флуоресцентную визуализацию для одновременного обнаружения вирусной ДНК, РНК, белков и ядер клеток хозяина, окрашенных в разные цвета.

Такая визуализация на уровне отдельных клеток позволяет изучать различные стадии жизненного цикла вируса посредством одновременного выявления вирусной ДНК, РНК и белков в инфицированных клетках.

Для иммуноокрашивания интересующих белков после последней промывки обработайте каждое покровное стекло 20 µL блокирующего буфера и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре.

По окончании инкубации слейте блокирующий буфер и добавьте 20 мкл интересующих первичных антител, разведенных в PBS с Tween 20 и добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина. После одночасовой инкубации при комнатной температуре промойте стекла, дважды промывая их свежим раствором PBS с Tween 20 по 10 минут с встряхиванием при каждой промывке, после чего окрасьте образцы соответствующими вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре. По окончании инкубации промойте стекла дважды свежим раствором PBS с Tween 20 по 10 минут с встряхиванием при каждой промывке.

После второго промывания окрасьте ядра подходящим ядерным красителем в течение одной минуты при комнатной температуре, после чего проведите две промывки в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре с перемешиванием.