Очистка интасом прототипа пенистого вируса методом эксклюзионной хроматографии

Начните с суспензии, содержащей преципитаты интасом прототипа пенистого вируса (PFV), мономерных интеграз, олигомеров ДНК и белковых агрегатов.

Интасомы PFV представляют собой тетрамеры вирусных интеграз, комплексованные с синтетическими олигомерами, имитирующими вирусную геномную ДНК.

Добавьте солевой раствор в суспензию и инкубируйте на льду. Соль снижает электростатическое взаимодействие между интасомами, что способствует растворению осадков.

Осторожно перемешивайте образец путем пипетирования через равные промежутки времени для стимуляции сольватизации интасомы.

Центрифугируйте для осаждения оставшегося осадка и соберите супернатант, содержащий растворимые интасомы.

Возьмите предварительно уравновешенную колонку для эксклюзионной хроматографии, заполненную сшитыми агарозными гранулами, и нанесите супернатант на колонку.

Из-за своего большого размера белковые агрегаты и интасомы проходят мимо пор гранул и элюируются раньше.

Более мелкие мономерные интегразы и олигомеры проникают в поры гранул и элюируются позже.

Соберите первые элюируемые фракции, содержащие интасомы, для последующего анализа.

Подготовьте два наконечника для пипеток с широким отверстием, срезав от 2 до 4 мм с конца наконечника объемом 20 µL с помощью нового лезвия бритвы или скальпеля на чистой поверхности. Извлеките диализную трубку из диализного буфера. Чтобы предотвратить разбавление образца интасомы диализным буфером, который может остаться на конце трубки возле зажима, используйте микропипетку с узким наконечником, чтобы удалить излишки диализного буфера.

Снимите зажим с этого конца диализной трубки. При извлечении комплекса важно собрать как можно больше раствора и осадка. Используйте наконечник для пипетки с широким отверстием, чтобы перенести образец, включая осадок, из диализной трубки в пробирку объемом 1,5 мл на льду.

Отметьте общий объем полученного материала. Обычно общий объем составляет приблизительно 140 µL. Образец с осадком содержит 20 mM NaCl.

Увеличьте концентрацию соли до конечного значения 320 мМ NaCl, добавив соответствующий объем стокового 5 М раствора NaCl. Перенесите контейнер со льдом и образцом в холодильную камеру при 4 ˚C. Используйте наконечник для пипетки с широким отверстием, чтобы ресуспендировать и растворить осадок путем пипетирования.

Повторяйте процедуру каждые 20 минут в течение как минимум одного часа. Большая часть осадка должна перейти в раствор. Для очистки интасомы уравновесьте колонку для эксклюзионной хроматографии (SEC) со сшитым агарозовым наполнителем, используя рабочий буфер для SEC при скорости потока 0,4 мл/мин.

Центрифугируйте образец интасомы в микроцентрифуге при 14,0 ×g в течение 10 минут при 4 ˚C для осаждения любого оставшегося осадка. После осторожного удаления супернатанта нанесите его в инжекционную петлю объемом 20 µL. Введите образец в колонку для SEC.

Элюируйте 25 мл рабочего буфера для SEC и соберите 95 фракций по 270 мкл. Обратите внимание, что на хроматограмме SEC отображаются три пика A280 и A260.