Сбор частиц вируса гепатита E из клеток рака печени человека

Начните с культуры клеток рака печени человека, трансфицированных РНК вируса гепатита E (HEV) для получения вирусных частиц.

Некоторые частицы HEV приобретают эндосомальную мембрану хозяина и выходят из клетки, в то время как другие остаются внутри клетки в виде неимеющих оболочки HEV.

Для сбора внеклеточных частиц HEV соберите и отфильтруйте супернатант культуры, чтобы удалить клеточный дебрис.

Хранить при ультранизкой температуре для сохранения инфекционности.

Для сбора внутриклеточных частиц HEV промойте клетки буфером.

Добавьте трипсин-ЭДТА для отсоединения клеток, затем добавьте среду для остановки ферментативной активности.

Перенесите суспензию в пробирку и центрифугируйте.

Удалите супернатант, содержащий остаточный трипсин. Ресуспендируйте осадок и перенесите его в пробирку.

Заморозьте клетки в жидком азоте, а затем разморозьте их на льду.

Повторяйте циклы замораживания-оттаивания до лизиса клеток и высвобождения вирусов.

Центрифугируйте образец, соберите супернатант, содержащий вирусы, и храните при ультранизкой температуре.

На шестой день профильтруйте супернатант через сетку с размером пор 0.45 мкм для удаления клеточного дебриса и храните полученный внеклеточный вирус гепатита Е, выращенный в клеточной культуре, при температуре 4 °C. Для сбора внутриклеточных частиц вируса гепатита Е, выращенного в клеточной культуре, промойте клетки PBS и отделите их, добавив 1.5 мл 0.05% трипсина-ЭДТА при 37 °C. После того как клетки отделятся, остановите реакцию, добавив 8.5 мл DMEM, и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл для центрифугирования.

Добавьте по 1,6 миллилитра полной среды DMEM для каждой электропорации в отдельные реакционные пробирки объемом два миллилитра и используйте 800 микролитров среды для ресуспендирования клеток, перенося их таким образом в пробирки. Заморозьте клетки в жидком азоте, затем трижды разморозьте их на льду, после чего центрифугируйте полученные лизаты на высокой скорости в течение 10 минут при 10,000 ×g. Затем перенесите супернатанты в новые пробирки, не затрагивая осадки клеточного дебриса, для хранения при минус 80 градусов Цельсия.