Очистка вируса из аллантоической жидкости эмбрионированных куриных яиц

Начните с резервуара, содержащего аллантоическую жидкость, полученную из инфицированных вирусом куриных яиц.

Эта жидкость содержит вирусные частицы, а также примеси, происходящие от организма хозяина.

Пропустите жидкость через глубинный фильтр, чтобы задержать крупные загрязнения, позволяя при этом проходить более мелким примесям и вирусам.

Затем загрузите отфильтрованную жидкость в систему фильтрации, где она будет течь тангенциально по поверхности мембраны.

Более мелкие загрязнения проходят через мембрану, в то время как вирус задерживается и концентрируется.

Нанесите концентрированный вирус на градиент плотности и центрифугируйте его. Вирус образует отчетливую полосу в том месте, где его плотность совпадает с плотностью градиента.

Соберите полосу, обогащенную вирусом, в диализную кассету и поместите ее в буфер. Компоненты градиента диффундируют наружу, в то время как вода из буфера диффундирует внутрь через полупроницаемую мембрану.

Затем поместите кассету в гипертонический раствор, чтобы вывести воду и сконцентрировать очищенный вирус.

Для очистки вируса болезни Ньюкасла или NDV сначала подготовьте предварительно настроенную экспериментальную систему, пропустив через нее 50 milliliters PBS.

Остановите насос, когда в пробирке останется примерно пять миллилитров PBS. Затем подсоедините к трубкам глубинный фильтр с рейтингом задержки от одного до трех микрометров. Чтобы удалить воздух из фильтра, снимите вторую крышку с апикальной стороны глубинного фильтра, после чего пропустите через систему еще 50 миллилитров PBS.

Как только PBS начнет вытекать через вентиляционное отверстие в верхней части фильтра, закройте порт и продолжайте пропускать PBS через линии. После этого замените емкость для отходов новой стерильной емкостью для сбора и начните пропускать аллантоическую жидкость через глубинный фильтр. Затем настройте систему тангенциальной поточной фильтрации (TFF) в открытой конфигурации и проводите процедуру согласно описанию в рукописи.

Когда в резервуаре останется около пяти миллилитров жидкости, остановите насос и добавьте в резервуар аллантоидную жидкость, прошедшую глубинную фильтрацию. Затем возобновите поток насоса. Чтобы предотвратить разрушение вируса вследствие сдвиговых напряжений, важно следить за тем, чтобы давление в системе не превышало 10 pound force per square inch.

Для увеличения эффективности элюции следует использовать комбинацию регулировки скорости перистальтического насоса и зажимов C-clamp. Когда в резервуаре останется от 150 до 100 мл аллантоической жидкости, остановите насос и замените буфер, добавив от 150 до 200 мл буфера ML. Снова остановите насос, когда в резервуаре останется от 5 до 10 мл жидкости, затем с помощью двух зажимов C-clamp перекройте линии слива.

Отсоедините линию ретента, подающую жидкость в резервуар, и поместите ее в коническую пробирку объемом 50 мл. Затем возобновите поток и остановите его, когда в резервуаре останется всего несколько капель жидкости. После этого снимите C-образные зажимы с линий отвода отходов и снова подсоедините линию подачи ретента к резервуару.

Тем временем, для подготовки к ультрацентрифугированию в градиенте плотности иодиксанола, сначала добавьте 0.5 milliliters 40% iodixanol в тонкостенную пробирку для ультрацентрифуги с открытым верхом объемом 13.2 milliliter. Затем сформируйте колонку путем последовательного добавления 2.5 milliliters 20% iodixanol и 2.5 milliliters 10% iodixanol. Перед ультрацентрифугированием осторожно добавьте от шести до 6.5 milliliters вирусного раствора, элюированного из системы TFF, в колонку с иодиксанолом, не нарушая градиент.

После ультрацентрифугирования извлеките пробирки с помощью стерильного пинцета. Целевая полоса должна представлять собой широкую полосу между градиентами 10 и 20%. Затем закрепите пробирку над стаканом с помощью штатива.

После этого прикрепите иглу длиной 1,5 дюйма и диаметром 18 gauge к шприцу объемом 5 мл, проколите иглой боковую стенку пробирки для ультрацентрифуги и извлеките целевую полосу, медленно вытягивая поршень. После удаления йодиксанола из вирусного раствора, как описано в рукописи, с помощью шприца осторожно введите вирус в диализную кассету. Чтобы сконцентрировать вирусный раствор, извлеките диализную кассету из диализного буфера и поместите ее в небольшой герметичный пластиковый пакет.

Затем добавьте в пакет от 15 до 25 мл 40% полиэтиленгликоля, чтобы диализная кассета была полностью погружена в раствор.