Репрограммирование клеток крови человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с помощью вируса Сендай

Возьмите культуру мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) человека.

Добавьте вирус Сендай, кодирующий транскрипционные факторы репрограммирования. Накройте и герметично закройте планшет.

Центрифугируйте для усиления контакта вируса с клетками, затем инкубируйте.

После слияния вируса вирусная РНК экспрессирует факторы транскрипции, которые активируют гены клеточной плюрипотентности и подавляют гены, специфичные для определенных линий, для инициации репрограммирования.

В течение этого времени часть трансдуцированных PBMC превращается в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) и начинает экспрессировать адгезивные белки.

Перенесите их в лунку, покрытую матриксом, и центрифугируйте клетки. Замените супернатант на ростовую среду.

После инкубации иПСК прикрепляются к матриксу, в то время как трансдуцированные неадгезивные PBMC остаются во взвеси.

Перенесите суспензию в покрытую лунку и центрифугируйте. Добавьте среду в исходную лунку и инкубируйте обе.

Оставшиеся трансдуцированные PBMC начинают перепрограммирование, превращаются в iPSC и прикрепляются. Этот этап позволяет максимально увеличить выход перепрограммированных клеток.

Ежедневно заменяйте среду для поддержания роста iPSC.

В данной процедуре перенесите клетки крови в коническую пробирку объемом 15 мл и подсчитайте их с помощью гемоцитометра. Затем подготовьте 3 × 10⁵ клеток для трансдукции и центрифугируйте их при 515 × g в течение пяти минут при комнатной температуре.

После этого удалите супернатант с помощью аспиратора и ресуспендируйте клетки в 0,5 мл среды для клеток крови. Затем перенесите клетки в лунку некоатированного 24-луночного планшета. Разморозьте смесь вируса Сендай на льду и добавьте ее к суспензии клеток.

Герметизируйте планшет с помощью sealing-пленки и центрифугируйте его при 1,150 ×g в течение 30 минут при 30 °C. После центрифугирования инкубируйте клетки при 37 °C в среде с 5% CO2 в течение ночи. Для покрытия 24-луночного планшета витронектином на следующий день разведите раствор витронектина в PBS до конечной концентрации 5 µg/ml.

Затем добавьте один миллилитр витронектина в лунку и инкубируйте при комнатной температуре не менее одного часа. После этого удалите раствор для покрытия и перенесите всю среду, содержащую клетки и вирус, в покрытую лунку. Затем соберите оставшиеся клетки, добавив еще 0,5 миллилитра свежей среды для клеток крови, и перенесите их в лунку с клетками.

Затем центрифугируйте планшет при 1,150 ×g в течение десяти минут при 35 °C, после чего инкубируйте клетки при 37 °C в 5% CO2 в течение ночи. Для второго переноса клеток покройте лунку витронектином в концентрации 5 µg/ml, как описано ранее. Используйте одну лунку планшета для каждой трансдукции и перенесите клеточную суспензию из первого планшета в новый планшет, покрытый витронектином.

Тем временем добавьте 1 ml среды для iPSC в лунку первого планшета для поддержания клеток и инкубируйте ее при 37 °C в 5% CO2, ежедневно заменяя среду на свежую среду для iPSC. Колонии появятся на 14–21 день после трансдукции. Центрифугируйте вновь покрытый планшет с суспендированными клетками при 1,150 ×g и 35 °C в течение 10 мин.

После центрифугирования инкубируйте клетки при 37 °C в 5% CO2 в течение ночи. На следующий день удалите супернатант и замените его свежей средой для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Поддерживайте прикрепленные клетки, ежедневно меняя среду, до достижения 80% конфлюэнтности.