Анализ интернализации вируса гриппа с помощью метода блокировки стрептавидином

Начните с пробирок, содержащих эпителиальные клетки легкого человека.

Добавьте биотинилированные вирусы гриппа и инкубируйте на льду. Вирусы связываются с поверхностью клеток, не интернализуясь.

Центрифугируйте образец для осаждения клеток, связавших вирус, удалите супернатант и ресуспендируйте осадок.

В пробирку для начальной временной точки добавьте немеченый стрептавидин, который связывается с биотинилированными вирусами, образуя комплексы.

Добавьте меченный флуорофором стрептавидин, который не связывается со стрептавидин-биотин-вирусным комплексом. Промойте и зафиксируйте клетки.

Инкубируйте пробирку для более поздней временной точки при более высокой температуре, чтобы обеспечить интернализацию вируса, затем снова поместите её на лёд.

Добавьте немеченый стрептавидин и агент, блокирующий интернализацию, чтобы предотвратить дальнейшее поглощение вируса, и инкубируйте. Стрептавидин связывается с биотинилированными вирусами на поверхности, после чего следует промывка.

Зафиксируйте клетки и добавьте буфер, содержащий детергент, для их пермеабилизации.

Промойте и добавьте стрептавидин, меченный флуорофором, который проникает в клетки и связывается с биотином.

Проанализируйте образцы методом