Анализ интернализации вируса гриппа с помощью метода блокировки стрептавидином

Начните с пробирок, содержащих эпителиальные клетки легкого человека.

Добавьте биотинилированные вирусы гриппа и инкубируйте на льду. Вирусы связываются с поверхностью клеток, не интернализуясь.

Центрифугируйте образец для осаждения клеток, связавших вирус, удалите супернатант и ресуспендируйте осадок.

В пробирку для начальной временной точки добавьте немеченый стрептавидин, который связывается с биотинилированными вирусами, образуя комплексы.

Добавьте меченный флуорофором стрептавидин, который не связывается со стрептавидин-биотин-вирусным комплексом. Промойте и зафиксируйте клетки.

Инкубируйте пробирку для более поздней временной точки при более высокой температуре, чтобы обеспечить интернализацию вируса, затем снова поместите её на лёд.

Добавьте немеченый стрептавидин и агент, блокирующий интернализацию, чтобы предотвратить дальнейшее поглощение вируса, и инкубируйте. Стрептавидин связывается с биотинилированными вирусами на поверхности, после чего следует промывка.

Зафиксируйте клетки и добавьте буфер, содержащий детергент, для их пермеабилизации.

Промойте и добавьте стрептавидин, меченный флуорофором, который проникает в клетки и связывается с биотином.

Проанализируйте образцы методом проточной цитометрии.

Более высокая интенсивность флуоресценции в более поздней временной точке подтверждает успешную интернализацию вируса.

После повторного промывания охладите пробирки на льду в течение 10 минут. После охлаждения пробирок снова центрифугируйте их и используйте 100 µL биотинилированного вируса, разведенного в PBS для инфицирования, чтобы ресуспендировать осадки; после инкубации на льду в течение одного часа повторите центрифугирование и дважды промойте PBS, обрабатывая следующие образцы для нулевой временной точки максимально параллельно.

Для обработки образцов «0 минут плюс STV» центрифугируйте пробирки, удалите супернатант и используйте 15 µL STV с 2% BSA и 0.1% азидом натрия в PBS для ресуспендирования осадка клеток. Инкубируйте на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируйте и используйте PBS для двукратной промывки клеток после фиксации PFA, как было показано ранее; храните образцы при температуре 4 °C.

Для образцов с инкубацией 30 минут плюс STV: после осаждения ресуспендируйте образцы в 200 µL PBS с 2% BSA, после инкубации при 37 °C в течение 30 минут.

Центрифугируйте и ресуспендируйте клетки в 50 µL раствора STV, 2% BSA и 0,1% азида натрия в PBS, инкубируйте на льду в течение 30 минут перед промывкой и фиксацией. Затем, после пермеабилизации и окрашивания всех образцов STV-Cy3 согласно подробным инструкциям в текстовом протоколе, храните образцы при температуре 4 °C. В завершение проанализируйте образцы с помощью проточной цитометрии.