Оценка подавления бактериального роста с помощью бактериофагов с использованием измерений оптической плотности

Используйте многолуночный планшет, содержащий серийные разведения суспензии фагов в питательном бульоне в качестве опыта и бульон без фагов в качестве контроля.

Добавьте E. coli в каждую лунку. С помощью спектрофотометра измерьте базовую оптическую плотность (OD), чтобы зафиксировать начальную концентрацию бактерий.

Затем инкубируйте планшет для обеспечения роста бактерий и инфекции фагами.

В контроле бактерии потребляют питательные вещества и размножаются, что приводит к увеличению OD.

В ходе обработки фаги связываются с рецепторами на поверхности бактерий и вводят свои геномы в цитоплазму.

Используя аппарат клетки-хозяина, вирусный геном реплицируется и синтезирует вирусные белки, которые собираются в новые вирусные частицы. Эти частицы лизируют клетку, высвобождая потомство.

Измеряйте OD через определенные интервалы времени для сравнения роста бактерий.

В контрольных лунках наблюдается постепенное увеличение OD, в то время как в лунках, обработанных фагами, значения OD ниже, при этом более значительное снижение отмечается при более высоких концентрациях фагов.

Это помогает определить концентрацию фага, необходимую для максимального подавления роста бактерий.

Для начала подготовьте микропланшетный анализ, используя фильтрующие наконечники во избежание перекрестного загрязнения. Сначала добавьте 180 µL mTSB в лунки с первого по двенадцатое столбцы 96-луночного микропланшета. Затем для проведения анализа подготовьте серийные десятикратные разведения каждого фага в столбцах с первого по восьмой стерильных 96-луночных микропланшетов. Добавьте 20 µL отдельных фагов или коктейлей фагов в лунки с первой по восьмую верхнего ряда A микропланшета.

Для контроля без фагов и холостого контроля добавьте 20 µL mTSB в верхние лунки столбцов с девятого по двенадцатый. При дозировании перемешивайте содержимое лунки путем осторожного и многократного аспирирования (не менее пяти раз), меняя наконечники между разведениями. Удалите 20 µL из последней строки H, затем подготовьте резервуар для тестируемого бактериального штамма, перенеся 2–3 mL разведенной культуры в резервуар с помощью одномиллилитрового дозатора.

С помощью многоканального дозатора внесите по 20 µL разведенной бактериальной культуры в каждую лунку с первой по десятую колонку, заменяя наконечники после каждого добавления. Закройте и инкубируйте микропланшет при 37 °C. Через каждые два часа извлекайте микропланшет из инкубатора и считывайте данные с помощью планшетного ридера.

В качестве альтернативы инкубируйте планшет в микропланшетном ридере и проводите измерения в динамике.