Маркирование реплицирующихся геномов HSV-1 с помощью нуклеозидного аналога

Возьмите культуру клеток млекопитающих в стационарной фазе с минимальной репликацией ДНК и соберите кондиционированную среду.

Добавьте вирус простого герпеса (HSV) и инкубируйте, периодически встряхивая, для обеспечения прикрепления вируса. Промойте для удаления несвязавшегося вируса и восстановите кондиционированную среду.

После инкубации вирус сливается с мембраной хозяина, высвобождая нуклеокапсид в цитоплазму.

Вирусная двухцепочечная ДНК (дцДНК) проникает в ядро, циклизуется и экспрессирует вирусные белки для репликации вирусной ДНК.

Вирусные и клеточные белки расплетают вирусную ДНК и синтезируют РНК-праймер. Затем комплекс вирусной ДНК-полимеразы связывается с праймером и удлиняет его для синтеза ДНК.

По мере протекания репликации добавьте в культуру аналог нуклеозида. Он проникает в клетки и преобразуется в трифосфатную форму.

Поскольку репликация ДНК хозяина минимальна, аналог преимущественно встраивается в реплицирующуюся вирусную ДНК, маркируя вирусные геномы.

Меченые вирусные геномы готовы к последующему протеомному анализу ассоциированных с ними белков.

Начните выполнение данной процедуры с культивирования клеток MRC-5, как описано в текстовом протоколе. Затем разведите HSV-1 в холодном трис-буферном физиологическом растворе (TBS). На следующих этапах важно выключить обдув и вытяжной шкаф для культивирования тканей, чтобы предотвратить высыхание клеток.

С помощью пипетки перенесите питательную среду от клеток MRC-5 в стерильный флакон, чтобы затем добавить её обратно к клеткам после инфицирования. Инфицируйте клетки, добавив к ним семь миллилитров разведенного вируса. В течение одного часа при комнатной температуре аккуратно перемешивайте клетки, покачивая планшет, каждые 10 минут.

После адсорбции аспирируйте инокулят, промойте клетки 50 мл TBS комнатной температуры и замените исходную ростовую среду. Затем инкубируйте клетки при 37 °C в присутствии 5% CO2. После начала репликации вирусной ДНК, примерно через четыре часа после инфицирования, проведите мечение реплицирующейся вирусной ДНК.

Для этого разведите EdC в одном миллилитре ростовой среды и добавьте его в культуральную среду инфицированных клеток на два-четыре часа.