Выделение белков из вирусных ДНК-белковых комплексов

Возьмите ядра клеток, содержащие вирусные геномы, меченные алкин-модифицированными нуклеотидами.

Суспендируйте ядра в смеси биотин-азида и ионов меди, затем инкубируйте.

Ионы меди способствуют образованию ковалентной связи между азидной и алкиновой группами.

Центрифугируйте и удалите супернатант.

Ресуспендируйте в буфере, перенесите и центрифугируйте для получения осадка.

Быстро заморозьте, а затем разморозьте осадок, чтобы облегчить лизис.

Ресуспендируйте и подвергните воздействию ультразвука для лизиса ядер.

Центрифугируйте образец и соберите супернатант, содержащий комплексы белков с вирусной ДНК.

Отфильтруйте супернатант для удаления примесей.

Разбавьте фильтрат.

Добавьте магнитные бусины, покрытые стрептавидином, и проинкубируйте для обеспечения связывания с биотинилированными белково-ДНК-комплексами.

Приложите магнитное поле для сбора магнитных частиц и проведите промывку для удаления загрязнений.

Повторите промывку.

Добавьте элюирующий буфер и нагрейте пробу, чтобы разделить и денатурировать белки.

Отделите магнитные бусины, соберите элюат.

Быстро заморозьте выделенные белки. Храните при ультранизких температурах для последующего анализа.

После полного удаления PBS повторно суспендируйте осадок ядер в 10 миллилитрах смеси для клик-реакции, осторожно пропипетировав образец вверх-вниз пять раз с помощью пипетки на 10 миллилитров. Инкубируйте образец в ротаторе в течение одного часа при температуре 4 °C, после чего осадите ядра, как описано ранее.

Полностью удалите смесь для клик-реакции, затем промойте осадок, осторожно ресуспендировав его в 10 milliliters PBS и повторно центрифугировав. Теперь аккуратно ресуспендируйте ядерный осадок в одном milliliter PBS и перенесите раствор в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 milliliter. После центрифугирования полностью удалите PBS и подвергните осадок мгновенному замораживанию в жидком азоте.

На данном этапе осадок можно хранить при 80 °C или продолжить процедуру. Для лизиса ядер и фрагментации ДНК ресуспендируйте размороженные ядра в 500 µL буфера B1, несколько раз пропипетировав суспензию. Инкубируйте суспензию на льду в течение 45 минут.

Затем подвергните образцы воздействию ультразвука шесть раз по 30 секунд каждый при амплитуде 40%, используя микрозонд с наконечником диаметром три миллиметра. Между импульсами выдерживайте образцы на льду не менее 30 секунд. После соникации образцы должны стать прозрачными, без помутнения.

Осадите клеточный дебрис путем центрифугирования при 14 000 ×g в течение 10 минут при четырех градусах цельсия. Размер осадка должен существенно уменьшиться; профильтруйте супернатант через клеточный фильтр с размером пор 100 микрон и соберите фильтрат. Затем добавьте 500 микронлитров Буфера B2 к профильтрованному супернатанту.

Для связывания биотинилированной ДНК с частицами, покрытыми стрептавидином, подготовьте магнитные частицы со стрептавидином, перенеся 300 µL суспензии частиц в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Подготовьте по одной пробирке с частицами на каждый образец. Промойте частицы трижды, используя 1 мл буфера B2: для этого ресуспендируйте частицы путем вортексирования, затем поместите пробирку в магнит для отделения частиц и аспирируйте промывочный буфер.

Затем добавьте 900 µL образца к промытым бусинам. Оставшаяся часть образца будет использована для выделения исходной ДНК и белков. Инкубируйте суспензию при перемешивании в течение ночи при 4 °C.

На следующий день поместите образцы в магнитную стойку для микроцентрифужных пробирок и удалите супернатант. Осторожно ресуспендируйте гранулы в 1 мл буфера B2, после чего перемешивайте в режиме ротации при 4 °C в течение 5 минут. Снова удалите супернатант, используя магнитную стойку для микроцентрифужных пробирок.

В этот раз осторожно ресуспендируйте гранулы в одном миллилитре буфера B3 и инкубируйте при 4 °C в течение пяти минут при перемешивании на ротаторе. После удаления супернатанта из смеси с гранулами с помощью магнита, ресуспендируйте гранулы в 50 µL 2x буфера для образцов по Лэммли (Laemmli sample buffer) для элюции комплексов ДНК и белков. Затем прокипятите образцы при 95 °C в течение 15 минут.

Перемешайте смесь на вортексе, после чего быстро центрифугируйте образцы в микроцентрифуге. Поместите образцы на магнит и перенесите элюат в новую пробирку. В завершение подвергните образцы мгновенному замораживанию и храните их при 80 °C.

Проведите анализ белков в соответствии с текстовым протоколом.