Выделение эндогенных вирусов из диких Drosophila с использованием модифицированных пермиссивных клеточных линий

Начните с пробирки, содержащей анестезированных взрослых особей Drosophila одного пола и одного вида.

Добавьте буфер и гомогенизируйте смесь для высвобождения эндогенных популяций вирусов и бактерий.

Центрифугируйте гомогенат, затем пропустите супернатант через мембрану с помощью центрифугирования для удаления бактерий и клеточного дебриса.

Перенесите фильтрат в многолуночный планшет с модифицированными культурами клеток Drosophila, пермиссивными к РНК-вирусам, и инкубируйте.

Вирусы проникают в клетку-хозяина посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза.

После проникновения в клетку вирусный геном реплицируется с образованием двухцепочечных РНК (дцРНК) интермедиатов.

Клетки-хозяева экспрессируют белок-супрессор, который связывается с дсРНК, предотвращая ее деградацию ферментом защиты хозяина Dicer.

Это обеспечивает синтез вирусной РНК и экспрессию вирусных белков, способствуя репликации и амплификации вируса.

Высокая вирусная нагрузка угнетает рост клеток-хозяев и вызывает цитопатические эффекты.

Кратковременно центрифугируйте планшет.

Соберите супернатант, содержащий вирусные популяции, и храните его при низкой температуре для последующего анализа.