Напечатанное на 3D-принтере устройство с силиконовым покрытием для моделирования катетер-ассоциированной инфекции мочевыводящих путей

Возьмите многолуночный планшет, содержащий стерильную человеческую мочу.

Инокулируйте испытательные лунки бактериями. Контрольные лунки содержат только мочу.

Возьмем, к примеру, напечатанное на 3D-принтере устройство с силиконовым покрытием, имитирующее внутреннюю поверхность катетера, где биопленки образуются во время катетер-ассоциированных инфекций мочевыводящих путей.

Поместите его в лунки, запечатайте пластину и инкубируйте.

Бактерии прикрепляются к поверхности устройства, утилизируют питательные вещества из мочи и образуют биопленки.

Промойте устройство буфером, чтобы удалить слабо связанные бактерии.

Поместите устройство в многолуночную пластину, содержащую кристаллический фиолетовый цвет, который взаимодействует с биопленкой, окрашивая ее.

Промойте водой и высушите.

Погрузите устройство в многолуночный планшет, содержащий раствор кислоты, чтобы нарушить взаимодействие красителя с биопленкой и выпустить краситель в раствор.

Измерьте поглощение растворов в каждой лунке с помощью спектрофотометра.

Более высокая абсорбция в тестовых лунках по сравнению с контрольными лунками подтверждает образование биопленки на устройстве, что указывает на его пригодность для моделирования катетер-ассоциированной инфекции мочевыводящих путей.

Для начала получите объединенный образец человеческой мочи. Внесите 135 микролитров собранной человеческой мочи в каждую лунку 96-луночного планшета в соответствии с назначенной схемой.

Инокулируйте каждую тестовую лунку 15 микролитрами нормализованной бактериальной культуры на ночь, чтобы достичь конечного объема в 150 микролитров на лунку. Зарезервируйте не менее 100 микролитров этой культуры для последующих этапов валидации серийного разведения.

Подготовьте контрольные лунки, добавив 150 микролитров стерильной человеческой мочи в специальные лунки.

Теперь вставьте колышки в соответствующие лунки. Нажмите на крышку штифта, пока она не сядет заподлицо с тарелкой, и зафиксируйте ее крышкой микропланшета, при необходимости заклеив ее лентой.

Затем поместите модели с колышками в герметичную пластиковую ванну или пакет с влажным синим рулоном, чтобы предотвратить испарение. Инкубируйте статически в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

Для валидации инокулята следует добавить 180 микролитров PBS в строки со 2 по 6 первого столбца 96-луночного планшета перед добавлением зарезервированной культуры.

Теперь перелейте 20 микролитров из первой лунки во вторую, осторожно перемешивая, пипетируя вверх и вниз. Продолжайте серийное разведение до тех пор, пока исходный посевной материал не будет разбавлен до конечной лунки.

Затем нанесите 10 микролитровых пятен от каждого разбавления на соответствующую твердую среду в трех экземплярах. После ночной инкубации при 37 градусах Цельсия подсчитайте колонии с каждого места.

Для количественного определения биопленки извлеките модель штифта из микропланшета и переверните ее под пламенем или внутри шкафа микробиологической безопасности штифтами вверх. Выбросьте использованные микропланшеты.

Переложите крышку с колышком на свежую микропластину, содержащую 180 микролитров аликвот стерильного PBS, чтобы смыть неприлипшие клетки.

Затем, работая асептично, поместите на стол штатив для пробирок из стерильного стекла и прикрепите к нему верхнюю часть штатива, которая удерживает крышку от штифта.

С помощью микропипетки нанесите 600 микролитров стерильного PBS в каждую пробирку. Теперь вставьте крышку с колышками в штатив, убедившись, что колышки совпадают с пробирками. Снимите с крышки автоклавную ленту.

С помощью стерильных щипцов протолкните каждый колышек через крышку в пробирки, расположенные прямо под ними. Затем установите на место крышки пробирок и закрутите каждую пробирку на 60 секунд, чтобы вытеснить клетки, связанные с биопленкой.

Удалите 100 микролитров из каждой вихревой пробирки и выполните последовательное разведение в стерильном PBS, как это делалось ранее.

Чтобы окрашивать клетки кристаллическим фиолетовым, пипеткой 180 микролитров 0,1 процента веса на объем кристаллического фиолетового в стерильной дистиллированной воде в 24 испытательные лунки 96-луночного планшета. Вставьте промытую колышковую модель в соответствующие лунки и выдерживайте при комнатной температуре в течение 20 минут.

После окрашивания снимите модель колышка с пластины и выбросьте использованную пластину. В чистой ванне промойте всю модель колышка в проточной водопроводной воде с легким помешиванием.

После еще 2 стирок переверните колышек модели и дайте ему полностью высохнуть при комнатной температуре. Затем добавьте 180 микролитров 30% уксусной кислоты в новую 96-луночную пластину. Вставьте высушенную модель колышка в соответствующие лунки.

Когда инкубация будет завершена, извлеките колышковую модель из микропланшета. Измерьте оптическую плотность окрашенных лунок на глубине 540 нанометров с помощью считывателя микропланшетов или спектрофотометра.