Очистка содержащих геном аденовирусных векторов с помощью хлорида цезия

Начните с клеток млекопитающих, инфицированных аденовирусом.

Проведите многократное замораживание и оттаивание для лизиса клеток и высвобождения вирионов.

Центрифугируйте лизат для осаждения клеточного дебриса. Соберите супернатант, содержащий вирусные частицы.

Нанесите вирусный супернатант на ступенчатый градиент хлорида цезия для разделения по плотности.

Ультрацентрифуга для обеспечения миграции вирусных частиц в соответствии с их плотностью плавучести.

Целые вирионы, содержащие полный аденовирусный геном, обладают большей плотностью за счет упакованной ДНК и оседают в нижнюю полосу, в то время как более легкие пустые капсиды и клеточный дебрис остаются в верхних слоях.

Удалите верхние слои. Соберите нижнюю полосу вирионов, содержащих геном.

Ресуспендируйте вирионы в хлориде цезия с однородной плотностью и повторно подвергните ультрацентрифугированию для более точного разделения и концентрирования полноценных частиц.

Удалите верхние слои и соберите нижнюю полосу.

Проведите диализ образца для удаления хлорида цезия.

Высокоочищенные аденовирусные векторы, содержащие геном, теперь готовы к дальнейшему использованию.

Для подготовки вирусного лизата к очистке в градиенте хлорида цезия подвергните суспензию клеток с вирусом четырем циклам замораживания-оттаивания. Затем центрифугируйте вирусный лизат при 500 ×g в течение восьми минут при комнатной температуре.

Затем соберите супернатант, содержащий высокоемкие аденовирусы. Осторожно и медленно внесите пипеткой растворы хлорида цезия в пробирки в следующем порядке: 0.5 milliliters раствора с концентрацией 1.5 grams per cubic centimeter, three milliliters раствора с концентрацией 1.35 grams per cubic centimeter и 3.5 milliliters раствора с концентрацией 1.25 grams per cubic centimeter. Сверху на слой 1.25 grams per cubic centimeter осторожно нанесите примерно 4.5 milliliters очищенного супернатанта с вектором.

Центрифугируйте градиенты в ультрацентрифуге с использованием ротора с Each-out (поворотным) углом при 12 °C в течение как минимум двух часов при 226 000 ×g, чтобы отделить вирусные частицы, содержащие геном высокоемкого аденовируса, от пустых частиц и клеточного дебриса. После центрифугирования в верхней части пробирок образуется диффузная полоса клеточного дебриса. Ниже нее можно наблюдать две белые полосы.

Верхняя полоса содержит пустые частицы, тогда как нижняя полоса представляет собой высокоемкий аденовирус. Осторожно удалите слои клеточного дебриса и пустых частиц. Затем соберите по 1 mL из нижних полос каждой пробирки.

Перенесите вирус в стерильную пробирку объемом 50 мл. Добавьте к собранным вирусным частицам до 24 мл раствора хлорида цезия с плотностью 1,35 г/см³ и осторожно перемешайте. Заполните центрифужные пробирки доверху раствором хлорида цезия с плотностью 1,35 г/см³, содержащим вирус.

Затем центрифугируйте в ультрацентрифуге в течение ночи при 226,000 ×g и 12 °C, используя ротор с качающимися стаканами, с медленным ускорением и замедлением. Удалите верхние слои с помощью пипетки. Затем, используя новый наконечник пипетки, соберите высокоемкий аденовирус, находящийся в выраженной нижней полосе.

В завершение проведите диализ собранных вирусных частиц для замены буфера. Затем определите титр конечного препарата в соответствии с подробными инструкциями, изложенными в письменном протоколе.