JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 2:27 мин • August 31st, 2026
Начните с замороженной ткани рецеллюляризированной печени крысы, содержащей гепатоциты человека, встроенной в криосреду.
В этой ткани трансдуцированные гепатоциты экспрессируют изумрудно-зеленый флуоресцентный белок (EmGFP) — репортерный белок, кодируемый вирусным вектором.
Используйте криотом для нарезки тонких срезов, сохраняющих структуру клеток и тканей. Перенесите срезы на предметное стекло.
Обработайте срезы мягким детергентом для пермеабилизации клеточных мембран.
Нанесите первичные антитела к EmGFP, которые специфически связываются с флуоресцентным репортерным белком, экспрессируемым в трансдуцированных клетках.
Промойте для удаления несвязавшихся антител.
Добавьте вторичный антитело, конъюгированный с красным флуорофором, который связывается с первичным антителом, после чего проведите промывку.
Добавьте специфичный для ДНК синий флуоресцентный краситель, который связывается с клеточной ДНК.
При рассмотрении под флуоресцентным микроскопом колокализация красной флуоресценции с окрашенными в синий цвет ядрами подтверждает, что трансдуцированные гепатоциты в ткани печени успешно экспрессируют вирусный репортерный белок.
С помощью скальпеля вырежьте образцы из каждой доли печени толщиной около 0,5 см и длиной от 1,5 до 2 см. Инкубируйте срезы в 4% параформальдегиде с 4% сахарозой в течение 90 минут при 4 °C.
Затем трижды промойте образцы раствором PBS по одной минуте на каждую промывку. После промывки инкубируйте образцы в 8% растворе сахарозы в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день поместите образцы в криоформы, содержащие фиксирующий агент.
Избегайте попадания пузырьков воздуха. После загрузки полностью залейте образцы фиксирующим средством и поместите их при температуре -80 °C. После замораживания с помощью криостата подготовьте криосрезы образцов толщиной 10 µm.
Окрасьте образцы по мере необходимости, чтобы подтвердить рецеллюляризацию.