Создание клеток с кондиционным нокдауном с использованием тетрациклин-зависимой лентивирусной системы экспрессии шРНК

Возьмите культуру клеток человека.

Добавьте лентивирусы, кодирующие условную шпилечную РНК (shRNA), нацеленную на мРНК хозяина, под управлением тетрациклин-зависимого промотора, слитого с оператором.

Лентивирус также несет гены репрессора тетрациклина и белка устойчивости к антибиотику, находящиеся под контролем конститутивного промотора.

Инкубируйте для обеспечения доставки вирусной РНК в клетки-хозяева.

РНК преобразуется в кДНК и интегрируется в геном хозяина.

Промойте клетки, добавьте среду и инкубируйте их для обеспечения экспрессии репрессора тетрациклина и белка устойчивости к антибиотику, чтобы получить трансдуцированные клетки. Репрессор тетрациклина связывается с оператором и подавляет экспрессию shRNA.

Промойте клетки, добавьте среду с антибиотиками и инкубируйте.

Трансдуцированные клетки экспрессируют белок устойчивости к антибиотику, что обеспечивает их селективное выживание в присутствии данного антибиотика.

Добавьте в культуру доксициклин, аналог тетрациклина.

Доксициклин связывается с репрессором тетрациклина, препятствуя его связыванию с оператором и обеспечивая экспрессию shRNA.

shRNA перерабатывается в siRNA, которая встраивается в комплекс RISC и вызывает деградацию целево