Создание клеток с кондиционным нокдауном с использованием тетрациклин-зависимой лентивирусной системы экспрессии шРНК

Возьмите культуру клеток человека.

Добавьте лентивирусы, кодирующие условную шпилечную РНК (shRNA), нацеленную на мРНК хозяина, под управлением тетрациклин-зависимого промотора, слитого с оператором.

Лентивирус также несет гены репрессора тетрациклина и белка устойчивости к антибиотику, находящиеся под контролем конститутивного промотора.

Инкубируйте для обеспечения доставки вирусной РНК в клетки-хозяева.

РНК преобразуется в кДНК и интегрируется в геном хозяина.

Промойте клетки, добавьте среду и инкубируйте их для обеспечения экспрессии репрессора тетрациклина и белка устойчивости к антибиотику, чтобы получить трансдуцированные клетки. Репрессор тетрациклина связывается с оператором и подавляет экспрессию shRNA.

Промойте клетки, добавьте среду с антибиотиками и инкубируйте.

Трансдуцированные клетки экспрессируют белок устойчивости к антибиотику, что обеспечивает их селективное выживание в присутствии данного антибиотика.

Добавьте в культуру доксициклин, аналог тетрациклина.

Доксициклин связывается с репрессором тетрациклина, препятствуя его связыванию с оператором и обеспечивая экспрессию shRNA.

shRNA перерабатывается в siRNA, которая встраивается в комплекс RISC и вызывает деградацию целевой мРНК.

Это позволяет получить клетки с доксициклин-зависимым условным нокдауном.

Для создания стабильных клеточных линий начните с посева клеток рака толстой кишки HCT-116 и клеток рака молочной железы MDA-MB-231 в 12-луночный планшет из расчета 50,000 клеток на лунку.

Инкубируйте при 37 °C и 5% CO2. При достижении клетками 60-70% конфлюэнтности промойте их PBS и добавьте по 1 mL вируссодержащей среды в каждую лунку. На следующий день осторожно удалите вируссодержащую среду путем аспирации.

Затем после промывки клеток PBS добавьте среду, содержащую FBS без тетрациклина. Через 72 часа промойте клетки, как указано ранее, и добавьте среду с добавлением 1 µg/mL пуромицина для селекции вирусно-трансдуцированных клеток. Проведите селекцию вирусно-трансдуцированных клеток путем культивирования клеток в присутствии пуромицина в течение от 3 до 14 дней.

Наблюдайте частичное уничтожение клеток пуромицином в лунках с вирусно-трансдуцированными клетками. Нетрансдуцированные клетки в присутствии пуромицина расти не будут.

Проверьте эффективность условного нокдауна в устойчивых к пуромицину клетках рака толстой кишки HCT-116 и клетках рака молочной железы MDA-MB-231, добавив среду с различными концентрациями доксициклина и культивируя клетки в течение 72 часов.