Оценка титра лентивируса с помощью иммуноферментного анализа

Возьмите лентивирусные векторы, содержащие антиген HIV-1 p24 — белковый маркер, используемый для детекции.

Добавьте детергент для лизиса и высвобождения p24, затем проведите серийное разведение образца.

Возьмите микропланшет, покрытый моноклональными антителами к p24 и блокирующим агентом для предотвращения неспецифического связывания.

Добавьте разведения образцов и стандарты p24 в качестве контролей.

Инкубируйте для обеспечения взаимодействия p24 с антителами через специфический эпитоп, затем удалите несвязавшиеся компоненты.

Инкубируйте с поликлональными антителами к p24, которые связываются с различными эпитопами p24. Удалите все несвязавшиеся антитела.

Добавьте антитела, конъюгированные с пероксидазой, которые связываются с поликлональными антителами. Удалите несвязавшиеся антитела.

Добавьте субстрат пероксидазы, который преобразуется в окрашенный продукт.

Добавьте кислоту для инактивации пероксидазы и стабилизации продукта.

Измерьте абсорбцию, соответствующую интенсивности окраски, которая пропорциональна концентрации p24.

Постройте стандартный график и определите концентрации образцов для расчета вирусного титра.

Покройте планшет с высокой связывающей способностью на 96 лунок 10 мкл моноклональных антител к p24 в разведении 1:150 в соответствии с инструкцией к набору для анализа захвата антигена p24 ВИЧ-1 программы NIH по вакцинам против СПИДа. Инкубируйте планшет в течение ночи при 4 °C. На следующий день трижды промойте планшет 20 мкл 0,05% раствора TWEEN-20 в холодном PBS.

Чтобы избежать неспецифического связывания, заблокируйте планшет, добавив 20 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина, и выдержите в течение одного часа при комнатной температуре. Затем трижды промойте планшет 20 мкл 0,05% TWEEN-20 в холодном PBS. После этого подготовьте концентрированные и неконцентрированные образцы вектора до конечной концентрации 10%, разбавляя вектор дважды дистиллированной водой и Triton X-10.

Затем приготовьте стандарты HIV-1 методом двукратных серийных разведений, начиная с концентрации 5 ng/mL. После разведения концентрированных и неконцентрированных образцов вектора нанесите их на планшет в трех повторностях и инкубируйте при 4 °C в течение ночи. На следующий день промойте планшет, затем добавьте в каждую лунку по 10 µL поликлональных кроличьих антител к p24 и инкубируйте при 37 °C в течение четырех часов.

После шести промывок инкубируйте планшет с козьими антителами к кроличьим IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена, при 37 °C в течение одного часа. После многократного промывания инкубируйте планшет с пероксидазным субстратом TMB при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте 1 N соляную кислоту для остановки реакции. Измерьте оптическую плотность при 450 нм с помощью планшетного спектрофотометра.