Получение рекомбинантного аденоассоциированного вируса путем трансфекции плазмидами

Начните со смеси плазмид, суспендированных в питательной среде.

Первая плазмида несет геном рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV), кодирующий интересующий ген.

Вторая плазмида кодирует белки Rep и Cap.

Третья плазмида кодирует вспомогательные белки.

Добавьте агент для трансфекции к раствору плазмид. Тщательно перемешайте и инкубируйте.

Положительно заряженный трансфекционный агент связывается с отрицательно заряженной плазмидной ДНК, образуя комплексы.

Добавьте комплексы к монослою клеток млекопитающих. Инкубируйте.

Комплексы проникают в клетки посредством эндоцитоза.

Внутри клеток гены, закодированные в плазмидах, обеспечивают экспрессию вирусных белков.

Белок Rep обеспечивает репликацию вирусного генома, в то время как белки Cap формируют оболочки капсида.

Белок Rep совместно с хелперными белками упаковывает реплицированный вирусный геном в капсиды, формируя полноценные частицы AAV.

Рекомбинантные векторы AAV, несущие целевой ген, готовы к применению для доставки генов.

После создания конструктов rAAV9 и культивирования клеток HEK293 согласно текстовому протоколу, для трансфекции клеток на первый день смешайте 70 мкг плазмиды AAV Rep-Cap, 70 мкг плазмиды rAAV9 и 20 мкг вспомогательной плазмиды Ad в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Добавьте в пробирку 49 мл среды DMEM без FBS комнатной температуры и тщательно перемешайте. Затем, чтобы получить раствор PEI и ДНК в соотношении 4:1, добавьте в пробирку 1 360 мкл PEI и тщательно перемешайте.

Инкубируйте раствор при комнатной температуре от 15 до 30 минут. После инкубации добавьте по пять миллилитров раствора в каждую чашку с клетками объемом 150 мл. Культивируйте клетки при 37 °C и 5% CO₂ в течение 50–72 часов.