Очистка рекомбинантных вирусных частиц из трансфицированных клеток почек человека

Начните с клеточного лизата, содержащего клеточную ДНК, агрегированную с клеточными белками и вирусными частицами.

Добавьте ионы магния, а затем нуклеазу, чтобы активировать ферментативную деградацию клеточной ДНК и разрушить агрегаты ДНК–белок.

Центрифугируйте смесь для отделения клеточного дебриса и соберите супернатант, содержащий вирусные частицы.

Осторожно нанесите супернатант на ступенчатый градиент иодиксанола с возрастающей концентрацией сверху вниз, затем долейте в пробирку буфер.

Ультрацентрифуга для разделения компонентов по плотности. Вирусные частицы накапливаются на границе раздела слоев высокой и средней плотности.

Введите иглу в этот интерфейс и соберите вирусные частицы в пробирку.

Добавьте буфер, содержащий стабилизирующие компоненты, чтобы предотвратить агрегацию вирусных частиц.

Затем перенесите раствор в пробирку с мембранным фильтром.

Центрифугируйте образец для концентрирования вирусных частиц над фильтром.

Добавьте буфер с добавлением стабилизирующего агента и снова центрифугируйте для получения очищенных вирусных частиц.

Для сбора трансфицированных клеток отделите их от поверхности и суспендируйте, используя культуральную среду и многократное пипетирование. Затем перенесите клеточные суспензии в стерильные пробирки объемом 50 мл. Центрифугируйте клетки при 500 ×g в течение пяти минут.

Затем добавьте по пять миллилитров PBS в каждую пробирку и ресуспендируйте осадки клеток, после чего объедините все суспензии в одной пробирке объемом 50 мл. После центрифугирования клеток при 500 ×g в течение пяти минут удалите супернатант. Для очистки AAV ресуспендируйте осадок в 10 мл лизирующего буфера.

Заморозьте лизат при -80 °C или в бане с сухим льдом и этанолом. Затем разморозьте его при 37 °C. Перемешайте лизат на вортексе в течение одной минуты, после чего повторите цикл замораживания и размораживания еще два раза.

Затем добавьте хлорид магния до концентрации 1 mM в размороженный лизат. После этого добавьте нуклеазу до конечной концентрации 250 units/mL. Инкубируйте раствор при 37 °C в течение 15 минут для разрушения агрегатов ДНК и белков.

Центрифугируйте образец при 4 800 ×g и температуре 4 °C в течение 20 минут. Затем соберите супернатант. Тем временем, для приготовления 17%-го раствора градиента иодиксанола смешайте 5 мл 10X PBS с 0,05 мл 1 М хлорида магния, 0,125 мл 1 М хлорида калия, 10 мл 5 М хлорида натрия и 12,5 мл среды для градиента плотности.

Доведите общий объем водой до 50 миллилитров. После приготовления 25%, 40% и 60% градиентных растворов в соответствии с текстовым протоколом, с помощью иглы и шприца внесите пять миллилитров 17% градиентного раствора в полипропиленовую пробирку. Затем последовательно внесите по пять миллилитров 25%, 40% и 60% градиентных растворов.

Нанесите лизат на поверхность градиента. Затем заполните пробирку лизирующим буфером и закройте ее пробкой. Центрифугируйте градиент при 185,000 ×g и 16 °C в течение 90 минут.

После центрифугирования с помощью шприца соберите 40% вирусную фракцию, введя иглу калибра 21G в область раздела между 40% и 60% фракциями, полностью избегая слоя 25%. Смешайте вирусную фракцию со стерилизованным раствором полиоксиэтилен-полиоксипропилена (блок-сополимера ПЭГ-ППГ) в PBS до общего объема 15 milliliters. Перенесите смесь в фильтрационную трубку с порогом отсечения по молекулярной массе 100 kilodaltons.

Затем центрифугируйте образец при 2,000 ×g и температуре 4 °C в течение 30 минут. Слейте раствор из нижней части пробирки. Затем добавьте PEG-PPG в фильтрующую пробирку, чтобы довести объем до 15 milliliters.

Центрифугируйте пробирку при 2,000 ×g и температуре 4 °C в течение 20 минут. Повторив процедуру наполнения и центрифугирования еще дважды, соберите очищенную фракцию вируса rAAV9, оставшуюся над фильтром.