Бессмертие эндотелиальных клеток посредством ретровирусной трансдукции вирусных онкогенов

Возьмите среду, содержащую ретровирусные частицы, кодирующие вирусные онкогены и ген устойчивости к антибиотику.

Центрифугируйте среду для удаления клеточного дебриса.

Соберите супернатант, содержащий вирусные частицы, и нанесите его на культуру эндотелиальных клеток.

Инкубируйте для обеспечения проникновения вируса в клетки.

Вирусная РНК подвергается обратной транскрипции в ДНК, которая интегрируется в геном хозяина.

Ген устойчивости к антибиотику кодирует белок резистентности. Онкогены кодируют белки, которые связываются с белками-супрессорами опухолей, контролирующими деление клеток, и инактивируют их, тем самым увеличивая продолжительность жизни клеток.

Замените среду на свежую среду.

Проведите повторную инкубацию для обеспечения стабильной интеграции вирусной ДНК.

Удалите среду и промойте клетки.

Добавьте раствор для ферментативной диссоциации, чтобы отделить клетки.

Перенесите клеточную суспензию в пробирку, центрифугируйте и удалите супернатант.

Ресуспендируйте осадок и перенесите его в флакон.

Добавьте антибиотик в среду.

Выживают только клетки, экспрессирующие белок устойчивости к антибиотику, что позволяет селектировать клетки, иммортализованные белками вирусных онкогенов.

После инкубации в течение ночи соберите среду из культуры клеток PA317 и очистите ее путем центрифугирования при 300 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. Замените среду EGM в культуре эндотелиальных клеток с конфлюэнтностью 50% 12 миллилитрами очищенной среды PA317. Инкубируйте клетки в течение четырех часов.

Затем замените 6 мл среды PA317 на 6 мл свежей среды EGM и инкубируйте клетки в течение ночи. После этого удалите среду из культуры эндотелиальных клеток и добавьте 12 мл свежей среды EGM. Продолжайте инкубацию клеток еще в течение 48 часов.

Для субкультивирования эндотелиальных клеток удалите среду и промойте клетки 12 мл PBS без катионов. Затем добавьте 3 мл коммерческого раствора для ферментативной диссоциации и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 3 мин. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клетки при 300 ×g в течение 5 мин при комнатной температуре.

После центрифугирования ресуспендируйте клетки в свежей среде EGM и равномерно разделите суспензию по трем флаконам T75. Доведите объем культур до 12 миллилитров EGM на флакон. Затем добавьте G418 в концентрации 200 микрограмм на миллилитр для селекции трансдуцированных эндотелиальных клеток.