Определение распределения вирусной РНК в клетках хозяина методом флуоресцентной гибридизации in situ

Начните со стекла, содержащего пермеабилизированные инфицированные вирусом клетки хозяина, в которых вирусные РНК распределены между ядерным и цитоплазматическим компартментами.

Добавьте буфер для прегибридизации и инкубируйте в условиях повышенной влажности.

В буфере блокирующие реагенты блокируют сайты неспецифического связывания, а ингибиторы РНказ инактивируют РНказы и сохраняют целостность РНК.

Удалите буфер и добавьте денатурированные олигонуклеотидные зонды с меткой дигоксигенином, комплементарные вирусной РНК.

Инкубируйте в темноте для гибридизации зонда с РНК, затем проведите многократную промывку.

Добавьте фиксатор для стабилизации гибридов зонд-РНК, затем проведите многократную промывку. Добавьте буфер с добавлением детергента для поддержания проницаемости клеток.

Добавьте антитела к дигоксигенину, конъюгированные с зеленым флуорофором, которые взаимодействуют с дигоксигенином, затем проведите многократную промывку.

Зафиксируйте клетки для сохранения комплексов, затем снова промойте их.

Добавьте ДНК-связывающий краситель для окрашивания ядер. Несколько раз промойте образец, чтобы удалить излишки красителя.

Накройте препаратом покровным стеклом и загерметизируйте его.

С помощью конфокального микроскопа визуализируйте зеленую флуоресценцию, отражающую распределение вирусной РНК между ядром и цитоплазмой клетки-хозяина.

После трех промывок в PBS, как показано в видео, снова зафиксируйте образцы в 4% формальдегиде в PBS на 10-15 минут, после чего проведите вторую пермеабилизацию, как показано в видео. Затем накройте предметное стекло алюминиевой фольгой, чтобы сохранить флуоресцентный сигнал и предотвратить фотовыгорание.

Промойте клетки 2x раствором цитрата натрия (saline sodium citrate), после чего нанесите 45 µL раствора для гибридизации. После выдержки в течение одного часа при 37 °C в увлажненной камере добавьте дистиллированную воду к интересующим антисмысловым олигонуклеотидам, чтобы довести объем для денатурации до 10 µL. Денатурируйте олигонуклеотиды при 95 °C в течение пяти минут, затем добавьте по 35 µL свежего раствора для гибридизации на каждое стекло.

Затем инкубируйте образцы от 10–24 часов в увлажненной камере при 37 °C, защитив их фольгой. На следующий день промойте клетки дважды в течение 10 минут 2X раствором цитрата натрия при комнатной температуре, после чего проведите одну промывку в 1X растворе цитрата натрия в течение 10 минут при 25 °C.

После последнего промывания зафиксируйте клетки предварительно охлажденным 4% формальдегидом в PBS в течение 10–15 минут на льду, затем трижды промойте свежим PBS. Далее пермеабилизируйте образцы, как показано в инструкции, после чего проведите инкубацию с anti-digoxigenin-FITC и предварительно охлажденным 0,1% BSA в PBS в течение одного часа при температуре 4 °C. По окончании инкубации трижды промойте предметные стекла свежим PBS и зафиксируйте образцы предварительно охлажденным 4% параформальдегидом в PBS в течение 10–15 минут при температуре 4 °C.

После трех промывок в PBS окрасьте ядра с помощью DAPI в концентрации 0,4 µg/mL и предварительно охлажденного 0,5% раствора Triton-X в PBS в течение 15 минут на льду, после чего проведите три заключительных промывки в PBS. Заклейте стекла с использованием флуоресцентных бусин, если это необходимо для эксперимента, и подходящего средства для заключения. После удаления излишков средства для заключения стерильными салфетками загерметизируйте каждое покровное стекло несколькими слоями прозрачного лака для ногтей и используйте флуоресцентный микроскоп, чтобы подтвердить успешное выполнение эксперимента.

Затем можно сделать снимки на конфокальном микроскопе при 630-кратном увеличении, чтобы собрать изображения образцов в интервале от одного часа до одной недели после их закрепления.