Определение распределения вирусной РНК в клетках хозяина методом флуоресцентной гибридизации in situ

Начните со стекла, содержащего пермеабилизированные инфицированные вирусом клетки хозяина, в которых вирусные РНК распределены между ядерным и цитоплазматическим компартментами.

Добавьте буфер для прегибридизации и инкубируйте в условиях повышенной влажности.

В буфере блокирующие реагенты блокируют сайты неспецифического связывания, а ингибиторы РНказ инактивируют РНказы и сохраняют целостность РНК.

Удалите буфер и добавьте денатурированные олигонуклеотидные зонды с меткой дигоксигенином, комплементарные вирусной РНК.

Инкубируйте в темноте для гибридизации зонда с РНК, затем проведите многократную промывку.

Добавьте фиксатор для стабилизации гибридов зонд-РНК, затем проведите многократную промывку. Добавьте буфер с добавлением детергента для поддержания проницаемости клеток.

Добавьте антитела к дигоксигенину, конъюгированные с зеленым флуорофором, которые взаимодействуют с дигоксигенином, затем проведите многократную промывку.

Зафиксируйте клетки для сохранения комплексов, затем снова промойте их.

Добавьте ДНК-связывающий краситель для окрашивания ядер. Несколько раз промойте образец, чтобы удалить излишки красителя.

Накройте препаратом покровным стеклом и загерметизируйте его.

С помощью кон