Очистка векторов на основе аденоассоциированного вируса методом аффинной хроматографии

Используйте в качестве исходного материала отфильтрованный клеточный лизат, содержащий векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) и примеси клеточного происхождения.

Пропустите лизат через аффинную колонку на основе гепарина.

Белки вирусного капсида электростатически связываются с отрицательно заряженными гепариновыми группами.

Промойте колонку буфером для удаления несвязавшихся загрязняющих веществ.

Добавьте буфер, содержащий детергент, для солюбилизации мембранного дебриса.

Снова промойте буфером без детергента.

Внесите буфер с добавлением катионов для создания ионной среды, затем промойте умеренно солевым буфером для удаления слабосвязанных примесей.

Добавьте буфер с высокой концентрацией соли, чтобы разрушить взаимодействия между капсидом и гепарином и элюировать вирусные частицы.

Соберите элюционные фракции, обогащенные интактными вирусными частицами, и перенесите их в центрифужные концентраторы, оснащенные фильтрующими мембранами.

Центрифугируйте пробирки для удаления избытка буфера, затем соберите концентрированные вирусные фракции в отдельную пробирку.

Промойте мембрану буфером, чтобы восстановить остаточные вирусные частицы и максимально увеличить выход.

Разморозьте сырой лизат при температуре 4 °C в течение ночи.

После размораживания профильтруйте раствор через фильтр с порами 0,22 мкм. Непосредственно перед этапами очистки проведите пассивацию центрифугирующего концентратора, добавив по четыре миллилитра буфера для предварительной обработки фильтра на каждую используемую колонку с heparin-Sepharose. Поместите трубку в перистальтический насос.

Последовательно пропустите растворы и среды. Подготовьтесь к хроматографии, подключив колонку с heparin-Sepharose объемом 5 мл к трубкам и пропустив через колонку 25 мл среды Bazell DMEM. Затем нанесите на колонку отфильтрованный неочищенный лизат с концентрацией 0.2 µM при скорости потока одну-две капли в секунду.

Последовательно промывайте колонку, чтобы элюировать по 5 mL пять раз с помощью 300 мM раствора NaCl в HBSS с магнием и кальцием, и обозначьте пять элюатов как E1–E5. По готовности центрифугируйте центрифужный концентратор с буфером для предварительной обработки при 900 ×g в течение двух минут. Удалите фильтрат. Промойте фильтр центрифужного концентратора 4 mL HBSS с магнием и кальцием, центрифугируя при 1000 ×g в течение двух минут.

Затем добавьте элюат E2 в центрифужный концентратор и центрифугируйте при 1000 ×g в течение пяти минут. Удалите фильтрат. Аналогичным образом центрифугируйте элюат E3 в центрифужный концентратор до тех пор, пока объем концентрированного вируса не составит примерно один миллилитр.

Извлеките концентрированный вирус из центрифужного концентратора с помощью фильтрующего наконечника P200 и перенесите его в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. После сбора вируса промойте центрифужный концентратор 200 микролитрами HBSS с магнием и кальцием. В течение 30 секунд интенсивно перемешивайте раствор с помощью пипетирования, чтобы отделить прилипший к мембране вирус, и соберите концентрированный вирус в ту же центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Тщательно перемешайте содержимое пробирки.