Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 3:07 мин. • August 31st, 2026
Возьмите чашку для микроинъекций с каплей среды для культивирования эмбрионов в центре, покрытой минеральным маслом для предотвращения испарения.
Поместите чашку под инвертированный микроскоп.
Установите капилляр для микроинъекций и удерживающую пипетку в систему микроманипулятора под микроскопом.
Микроинъекционный капилляр заполняют суспензией лентивирусных векторов, несущих трансген.
Затем перенесите оплодотворенные эмбрионы крысы в среду.
Зафиксируйте эмбрион с помощью удерживающей пипетки, создав вакуум.
При большем увеличении введите капилляр для микроинъекций через внеклеточную гликопротеиновую оболочку эмбриона — zona pellucida — и введите суспензию лентивируса в перивителлиновое пространство.
Затем перенесите инъецированные эмбрионы в чашку для культивирования и инкубируйте.
Вирус проникает в эмбрион и высвобождает в цитоплазму свой геном, содержащий трансген.
Впоследствии он подвергается обратной транскрипции в ДНК и интегрируется в геном эмбриона, встраивая трансген.
Трансдуцированные эмбрионы теперь готовы к дальнейшей обработке.
Для микроинъекции лентивирусного вектора под zona pellucida эмбрионов на одноклеточной стадии используйте вытяжку для пипеток, чтобы подготовить микроинъекционные капилляры из боросиликатного стекла с нитью. Каждый раз после замены нити или при использовании нового стеклянного капилляра выполняйте тест Ramp для установки оптимальных параметров.
Затем в боксе с ламинарным потоком воздуха загрузите с помощью наконечника микрозагрузчика примерно 2 µL свежеразмороженного раствора лентивируса в каждую микроинъекционную пипетку. В центр крышки чашки Петри диаметром 60 mm поместите каплю среды M2 объемом 10 µL. Покройте среду минеральным маслом, затем установите удерживающую пипетку и микроинъекционный капилляр, заполненный вирусом, в микроманипулятор.
Поместите чашку для микроинъекций под инвертированный микроскоп и перенесите от 15 до 20 эмбрионов на стадии одной клетки в каплю среды M2 в чашке для микроинъекций. Зафиксируйте один эмбрион с помощью удерживающей пипетки и, используя 400-кратное увеличение и стеклянный капилляр, введите раствор лентивируса под zona pellucida в перивителлиновое пространство, удерживая капилляр под zona pellucida некоторое время после доставки вируса. Когда все эмбрионы будут инъектированы, с помощью тонкой пипетки перенесите инъектированные клетки обратно в чашку для культивирования и поместите чашку в инкубатор для культур клеток до момента их имплантации.