Очистка вирусной интегразы методом аффинной хроматографии

Начните с суспензии бактериальных клеток, экспрессирующих вирусную интегразу с полигистидиновым тэгом.

Проведите соникацию суспензии для разрушения бактериальных мембран и высвобождения интегразы.

Перенесите лизат в пробирку для ультрацентрифугирования.

Центрифугируйте на высокой скорости для осаждения клеточного дебриса и соберите супернатант.

Затем возьмите хроматографическую колонку, заполненную смолой с ионами никеля, и уравновесьте ее буфером.

Нанесите осветленный лизат на колонку.

Белки, содержащие гистидины, слабо связываются с никелем, в то время как интеграза с полигистидиновым тегом связывается прочно.

Промойте колонку буфером для удаления несвязавшихся белков, затем добавьте элюирующий буфер с линейно возрастающей концентрацией имидазола.

Имидазол конкурирует с гистидином за связывание с никелем, что приводит к высвобождению интегразы.

Соберите фракции и перенесите аликвоты в пробирки с буфером для нанесения.

Нагрейте образцы для денатурации белков, затем нанесите их на полиакриламидный гель.

Проведите электрофорез и проанализируйте белковые полосы.

Определите фракции, содержащие чистую интегразу без посторонних белков, и объедините их для получения очищенной вирусной интегразы.

Начните с размораживания на льду одной порции осадка E.coli, экспрессирующих интегразу прототипа пенистого вируса. Используйте соникатор, оснащенный биорогом диаметром 0,5 дюйма с коническим микронаконечником диаметром 0,125 дюйма, для соникации в течение 30 секунд при амплитуде 30%, удерживая пробирку на льду. После соникации перенесите образец клеток в холодную пробирку для ультрацентрифугирования и центрифугируйте при 120,000 ×g в течение 60 минут при температуре 4 °C.

После центрифугирования должен образоваться четко видимый осадок, а супернадант может иметь желтый цвет. Перенесите супернадант в охлажденную коническую пробирку объемом 50 мл. Затем подготовьте колонку для FPLC длиной 110 мм и диаметром 5 мм с 1,5 мл никель-заряженного сорбента.

Сначала подключите колонку к системе FPLC и подайте буфер. Прибор должен регистрировать данные о проводимости и УФ-поглощении при 280 нм в режиме реального времени. Показания проводимости и УФ-поглощения должны стабилизироваться.

При необходимости продолжайте пропускать буферы через колонку до стабилизации показателей. Используя суперпетлю, нанесите образец белка на колонку со скоростью потока 0,15 мл/мин при максимальном пределе давления 0,5 МПа. Подсоедините суперпетлю к системе AKTA FPLC.

После промывки колонки и элюции белков отберите аликвоты по 15 мкл начального проскока, промывки и фракций с пиком поглощения при 280 нм, и добавьте к каждому образцу 15 мкл 2X буфера для образцов SDS-PAGE. Прокипятите образцы в течение трех минут. Нанесите по 10 мкл каждого образца на 10% гели SDS-PAGE вместе с четырьмя мкл предварительно окрашенных стандартов белков.

Проведите визуальный анализ геля, чтобы определить фракции, которые, по всей видимости, содержат почти чистую интегразу прототипа пенного вируса. Объедините эти фракции и при дозировании отметьте их общий объем. Обычно он составляет от 8 до 10 мл.