Комбинированная аденовирусная трансдукция и siRNA-опосредованный нокдаун в раковых клетках

Возьмите культуру раковых клеток человека, экспрессирующих эндогенный целевой белок, и удалите среду.

Возьмите суспензию рекомбинантного аденовируса, несущего ген, который кодирует целевой белок с флуорофорной меткой.

Добавьте небольшой объем вирусной суспензии к клеткам, чтобы обеспечить тесный контакт между вирусом и поверхностью клеток.

Инкубируйте, периодически встряхивая планшет, чтобы обеспечить прикрепление вируса.

Добавьте в культуру дополнительную питательную среду.

Затем введите комплекс siRNA–фосфат кальция для таргетирования мРНК эндогенного целевого белка и инкубируйте.

Фосфат кальция способствует поглощению siRNA, после чего siRNA встраивается в комплекс RISC.

Затем комплекс siRNA–RISC связывается с целевой мРНК и расщепляет ее, подавляя экспрессию белка.

Одновременно с этим аденовирус проникает в клетку и высвобождает свою ДНК, которая обеспечивает экспрессию целевого белка с флуоресцентной меткой.

Это позволяет истощить запасы эндогенного целевого белка и одновременно заменить его белком, меченным флуорофором.

Промойте клетки буфером и проведите флуоресцентную визуализацию для анализа целевого белка.

Маркируйте микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для каждого условия и до