Маркирование доступных на поверхности остатков цистеина в сконструированных вирусоподобных частицах

Начните с суспензий мутантных вирусоподобных частиц (ВЛЧ), очищенных из инфицированных листьев табака.

Мутантные VLP содержат остатки цистеина, генетически вставленные в специфические позиции белка оболочки вируса.

Добавьте флуоресцентный краситель, конъюгированный с малеимидом, и инкубируйте смесь в темноте.

Малеимид связывается только с остатками цистеина, расположенными на поверхности VLP, в то время как цистеины, скрытые внутри структуры белка, остаются недоступными и не подвергаются мечению.

Добавьте восстановитель, чтобы заблокировать любой непрореагировавший краситель и предотвратить неспецифическое мечение.

Загрузите образцы в колонки для обессоливания, заполненные пористой смолой, затем центрифугируйте для очистки меченых VLP.

Непрореагировавшие красители и восстановители диффундируют в пористые смоляные гранулы и удерживаются в них, в то время как более крупные VLP исключаются из пор и элюируются первыми.

Теперь флуоресцентно меченые VLP можно проанализировать с помощью гель-электрофореза.

Флуоресцентные полосы на геле демонстрируют меченые мутанты с экспонированными на поверхности остатками цистеина.

После получения кэпированных T7-РНК-транскриптов из векторных плазмид на основе