Флуоресцентная функционализация вирусоподобных частиц посредством восстановления дисульфидных мостиков

Используйте в качестве исходного материала вирусоподобные частицы (ВЧ), содержащие дисульфидные связи на поверхности капсида.

Добавьте восстановитель для расщепления дисульфидных связей, что приведет к образованию свободных тиольных групп при сохранении структуры капсида.

Объедините восстановленные VLP с тиол-реактивным полиэтиленгликолем или ПЭГ-линкером, чтобы предотвратить повторное окисление тиолов.

Линкер PEG заново связывает каждую пару тиолов, образуя две ковалентные связи.

Эта ковалентная конъюгация также приводит к образованию флуоресцентной структуры, которая ярко-желтого цвета при УФ-освещении.

Перемешивайте смесь в течение длительного времени для обеспечения полного конъюгирования.

С помощью центрифужного фильтрования очистите ПЭГилированные VLP, удаляя непрореагировавшие малые молекулы и сохраняя при этом целые конъюгаты.

Проведите невосстанавливающий SDS-PAGE для обнаружения присоединения PEG, что будет выражаться в виде флуоресцентной полосы белка оболочки.

Оцените структурную целостность с помощью электрофореза в нативном агарозном геле; наличие схожих полос для ПЭГилированных и неПЭГилированных VLP подтверждает сохранение целостности VLP.

Данный протокол позволяет получить