Выделение инфекционных вирионов из клеток, трансфецированных синтетической РНК на основе бактериальной искусственной хромосомы

Начните с адгезивного монослоя клеток, чувствительных к вирусу.

Промойте клетки, затем добавьте диссоциирующий агент для их отсоединения.

Центрифугируйте и удалите супернатант. Промойте клетки для удаления остатков среды.

Ресуспендируйте клетки в буферном физрастворе, затем перенесите клетки в кювету.

Введите РНК, транскрибированную с полноразмерного кДНК-клона вируса японского энцефалита (JEV), который переносится бактериальной искусственной хромосомой.

Примените электрические импульсы для временного повышения проницаемости клеточной мембраны, чтобы обеспечить проникновение РНК.

Дайте клеткам восстановиться, затем перенесите их в культуральную среду.

Введенная РНК имитирует нативную вирусную РНК для продукции новых вирионов.

Выполните серийное разведение клеток и высейте их на свежие монослои клеток.

Инкубируйте для того, чтобы вирионы могли инфицировать соседние клетки.

Покройте клетки агарозной средой и инкубируйте. Среда образует полутвердый слой, ограничивающий распространение вируса на соседние клетки.

Инфицированные клетки лизируются и образуют отдельные бляшки, что подтверждает успешное восстановление инфекционного JEV.

Используйте клетки BHK-21, выращенные в течение 24 часов в чашках