Элеганс C. Положительные обучения бутанон, краткосрочный и долгосрочный Ассоциативные Анализы памяти

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы проверить кратковременную и долгосрочную память на выученную положительную связь между пищей и химиотерапией. Аттрактант бутан, используя в качестве модели C elegance. Это достигается путем первого голодания, синхронного, хорошо откормленного молодняка в течение одного часа.

Затем черви тренируются в присутствии пищи и бутана, известных как тучное обусловливание для кратковременной ассоциативной памяти и интервальное обусловливание для долговременной ассоциативной памяти. После кондиционирования хемотаксис по отношению к известному бутану измеряется и сравнивается с наивным хемотаксисом. Для изучения удержания памяти получены результаты, которые показывают длительность кратковременной и долговременной ассоциативной памяти на усвоенные бутаны известной ассоциации бутана на основе изменения индекса обучения.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области когнитивного старения и заболеваний, например, какие генетические пути необходимы для функционирования нейронов при нормальном старении и нейродегенеративных заболеваниях, а также как можно улучшить обучение и память. В условиях когнитивных нарушений червей готовят стандартными методами на 100-миллиметровых пластинах с питательной средой, рассаженных одним миллилитром OP 50 e coli. Используйте молодых особей при плотности около 5 000 червей или менее на тарелку.

Соберите червей, аккуратно насыпав на тарелку буфер M nine и освободив червей. Постарайтесь свести к минимуму перемешивание, которое может вытеснить нежелательные бактерии. Далее наклоните пластину и подтяните вверх смесь буферных червяков из угла.

С помощью трубки P 1000 Pepin. Переложите червей в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Будьте осторожны, чтобы не прижать червей к борту, если черви остались на тарелке.

Повторите этот шаг один-два раза. Дайте червям осесть на дно трубки под действием силы тяжести. Центрифугирование не рекомендуется для достижения наилучших результатов.

После того, как супинат осядет, удалите его с помощью вакуума и промойте не менее чем тремя-четырьмя миллилитрами буфера M nine. Работаем быстро, чтобы предотвратить голод. Повторите эту процедуру два раза, всего три стирки.

На этом этапе когорта червей может быть выделена в качестве наивной группы в анализах хемотаксиса, которые будут продемонстрированы позже, для подготовки червей к тренировке, добавить три-четыре миллилитра буфера М-9 в пробирку и дать червям голодать при комнатной температуре в течение одного часа, подготовить кондиционирующие пластины, добавив два микролитра 10%-ного бутана в 95%-ный этанол на внутреннюю сторону крышек 60-миллиметровых пластин NGM, которые были засеяны 500 микролитрами OP 50 e coli. Удалите супинат из трубки голодающих червей и с помощью трубки P 1000 Pepin переложите от 100 до 200 микролитров червей на каждую кондиционирующую пластину. Инкубируйте кондиционирующие планшеты при комнатной температуре в течение одного часа после кондиционирования.

Промойте червей с пластин примерно одним миллилитром буфера M nine и переложите в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Повторяйте описанные ранее методы щадящей промывки, пока буфер не станет прозрачным. После промывки подмножество червей может быть удалено и протестировано в анализе хемотаксиса, чтобы служить в качестве нулевой группы времени для ассоциативного обучения, умноженного на мачту, для создания пластин, представляющих дополнительные временные точки.

Перенесите от 100 до 200 микролитров червей в засеянные 60-миллиметровые пластины NGM. Инкубируйте эти планшеты после кондиционирования в течение 0,51 или двух часов при комнатной температуре. После каждого временного момента аккуратно смывайте червей с пластин в коническую трубку объемом 15 миллилитров и в один-два раза больше.

При использовании буфера M nine после тех же щадящих процедур промывки кратковременная ассоциативная память проверяется с помощью анализа хемотаксиса, который будет продемонстрирован позже. Подготовьте кондиционирующие пластины и червей, как показано на рисунке, для кратковременной тренировки, но дайте червям инкубироваться при комнатной температуре всего 30 минут. После инкубации соберите червей так, как было продемонстрировано ранее.

Перенесите их на НЕЗАСЕЯННЫЕ 60-миллиметровые пластины NGM. Поместите червей на несеменные тарелки при комнатной температуре в течение 30 минут После того, как черви уморят голодом, промойте червей буфером M nine и поместите обратно в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Повторяйте эти шаги, пока в общей сложности не будет завершено семь блоков кондиционирования и шесть блоков голодания.

Когда кондиционирование будет завершено, промойте червей из кондиционных пластин обратно в коническую трубку. Как было показано ранее, когорта червей может быть использована для тестирования ассоциативного обучения с семью интервалами сразу после обусловливания. Перенесите оставшуюся популяцию червей в 100-миллиметровые HGM-планшеты, сидящие с одним миллилитром OP 50.

Опять же, внесите от 100 до 200 микролитров червей на тарелку, чтобы убедиться, что бактерий достаточно для поддержания популяции. Инкубируйте планшеты после кондиционирования при температуре 20 градусов Цельсия в течение 1624 или 40 часов, представляющих временные точки долгосрочной ассоциативной памяти, чтобы проверить долгосрочную ассоциативную память на известную ассоциативную ассоциативную связь с пищей. Аккуратно смойте червей с пластин в 15-миллилитровую коническую трубку, и снова, один-два раза с буфером М девять после каждого временного момента и проверьте червей в химическом анализе Техаса.

Чтобы подготовить планшеты для анализа хемотаксиса, отметьте нижнюю часть неустановленных 100-миллиметровых пластин NGM пятнами по бокам в трех местах, как показано на рисунке. Пятните один микролитр одного молярного азида натрия в точках одоранта и контрольных точках. Не более чем за 15 минут до начала анализа свести к минимуму диффузию парализующих агентов.

Следующее пятно, по одному микролитру 95% этанола и 10%, но одно из соответствующих пятен на отмеченной пробной пластине. Сверху ранее пятнистый азид натрия. Удалите как можно больше буфера М девять из трубки с отстоявшимися червями.

Используйте трубку P 20 Pepin с предварительно вырезанным наконечником, чтобы доставить 15 микролитров червей через три пятилитровых интервала к исходной пластине для анализа. Затем закрутите угол салфетки Кима до небольшой точки и используйте его, чтобы промокнуть избыток буфера M nine. Будьте осторожны, чтобы не проколоть агар.

Удаление излишков буфера высвобождает червей на пробирную пластину. При использовании визуализации для подсчета червей, изображение происхождения сразу после этого выпуска даст общее количество животных для пробирной пластины. Инкубируйте планшет для хемотаксиса в течение одного часа при комнатной температуре после инкубации, подсчитайте количество червей в местах происхождения этанола и бутонов, а также общее количество червей на планшете для анализа.

Как правило, черви, парализованные азидом натрия, находятся в радиусе одного сантиметра от пятен и кажутся прямыми. Поскольку многие животные расположены друг против друга, червей можно подсчитать вручную или количественно оценить с помощью программного обеспечения для визуализации и анализа. Мы отдаем предпочтение последнему за простотой и достоверностью результатов.

После того, как черви в исходных пятнах этанола и бутона будут количественно определены, рассчитайте индекс KeyAx, как показано здесь. Типичный наивный индекс хемотаксиса для червей дикого типа, реагирующих на 10%бутон, составляет около 0,2. Обучение на мачте или интервалах обычно увеличивает индекс ХЕМОТАКСИС до 0,7-0,8 в разы на ноль, чтобы получить индекс обучения около 0,6.

Наивный хемотаксис очень чувствителен к правильному уходу за гельминтами. Этот рисунок демонстрирует заметную разницу в ДИ между сытыми и голодными наивными червями и подчеркивает важность правильной техники. Удержание памяти отражается в времени, которое требуется для того, чтобы индекс химиотерапии Техаса вернулся к наивным уровням, когда индекс обучения равен нулю у диких животных.

Кратковременная ассоциативная память начинает снижаться через час после массовой тренировки, длится около двух часов и по сравнению с ней не зависит от транскрипционного фактора креба. Долговременная ассоциативная память обычно не начинает значительно снижаться до 16 часов после того, как космическая тренировка длится до 40 часов. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что на анализы хемотаксиса может влиять голодание или чрезмерные запахи в окружающей среде, а также что память и черви могут быть нарушены из-за слишком сильного физического возбуждения.