Элеганс C. Положительные обучения бутанон, краткосрочный и долгосрочный Ассоциативные Анализы памяти

Общая цель следующего эксперимента заключается в проверке краткосрочной и долгосрочной памяти в отношении выученной положительной ассоциации между пищей и хемоаттрактантом бутаном с использованием *C. elegans* в качестве модели. Для этого сначала синхронизированных, хорошо накормленных молодых взрослых червей подвергают голоданию в течение одного часа.

Затем червей обучают в присутствии пищи и известного бутанола: с помощью массированного кондиционирования для формирования краткосрочной ассоциативной памяти и с помощью интервального кондиционирования для формирования долгосрочной ассоциативной памяти. После кондиционирования измеряют хемотаксис по направлению к известному бутанолу и сравнивают его с наивным хемотаксисом. Для изучения сохранения памяти получают результаты, которые показывают продолжительность краткосрочной и долгосрочной ассоциативной памяти об усвоенной связи между пищей и известным бутанолом на основе изменений индекса обучения.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области когнитивного старения и заболеваний, например, о том, какие генетические пути необходимы для функционирования нейронов при нормальном старении и нейродегенеративных состояниях, а также о том, как можно улучшить обучение и память. В условиях когнитивных нарушений червей подготавливают стандартными методами на чашках с питательной средой высотой 100 мм, засеянных 1 мл OP 50 e coli. Используйте молодых взрослых особей с плотностью около 5 000 червей или менее на чашку.

Соберите червей, осторожно налив буфер M9 на чашку и аккуратно перемешивая их для отделения от поверхности. Старайтесь свести к минимуму интенсивность перемешивания, чтобы избежать отделения нежелательных бактерий. Затем наклоните чашку и слейте смесь буфера с червями из угла.

С помощью пипетки P 1000 перенесите червей в коническую пробирку объемом 15 мл. Если на чашке остались черви, аккуратно перенесите их, стараясь не прижимать их пипеткой к стенкам.

Повторите этот этап один или два раза. Дайте червям осесть на дно пробирки под действием силы тяжести. Для достижения наилучших результатов центрифугирование не рекомендуется.

После осаждения удалите супернатант с помощью вакуума и промойте образец не менее чем тремя-четырьмя миллилитрами буфера M9. Действуйте быстро, чтобы избежать голодания клеток. Повторите эту процедуру еще дважды, чтобы в общей сложности провести три промывки.

На данном этапе можно выделить группу червей, которая будет служить контрольной (наивной) группой в анализах хемотаксиса, которые будут продемонстрированы позже; чтобы подготовить червей к обучению, добавьте в пробирку три-четыре миллилитра буфера M9 и оставьте червей голодать при комнатной температуре в течение одного часа. Подготовьте кондиционирующие чашки, нанеся два микролитра 10% бутанола в 95% этаноле на внутреннюю сторону крышек 60-миллиметровых чашек с NGM-агаром, на которые предварительно было засеяно 500 микролитров E. coli штамма OP50. Перемешайте содержимое пробирки с голодающими червями и с помощью дозатора P1000 перенесите от 100 до 200 микролитров суспензии червей на каждую кондиционирующую чашку. После кондиционирования инкубируйте чашки при комнатной температуре в течение одного часа.

Смойте червей с чашек примерно одним миллилитром буфера M9 и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл. Повторяйте описанный ранее метод осторожного промывания до тех пор, пока буфер не станет прозрачным. После промывки часть червей можно извлечь и протестировать в анализе хемотаксиса, чтобы они послужили группой нулевого момента времени для ассоциативного обучения с одной стимуляцией (1× mast) при подготовке чашек для дополнительных временных точек.

Перенесите от 100 до 200 мкл суспензии червей на подготовленные 60-миллиметровые чашки с NGM-агаром. Инкубируйте эти чашки после воздействия в течение 0,5, 1 или 2 часов при комнатной температуре. После каждой временной точки осторожно смойте червей с чашек в коническую пробирку объемом 15 мл, повторив процедуру еще один или два раза.

После промывки в буфере M9 по той же щадящей процедуре проводится проверка краткосрочной ассоциативной памяти с помощью анализа хемотаксиса, который будет продемонстрирован далее. Подготовьте планшеты для кондиционирования и червей, как показано для краткосрочного обучения, но оставьте червей инкубировать при комнатной температуре только на 30 минут. После инкубации соберите червей, как демонстрировалось ранее.

Перенесите их на НЕПОСЕВНЫЕ чашки с NGM диаметром 60 миллиметров. Голодайте червей на непосевных чашках при комнатной температуре в течение 30 минут. После голодания промойте червей буфером M nine и поместите их обратно в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Повторяйте эти шаги до завершения в общей сложности семи циклов кондиционирования и шести циклов голодания.

По завершении кондиционирования смойте червей с чашек для кондиционирования обратно в коническую пробирку. Как было показано ранее, группу червей можно использовать для проверки ассоциативного обучения с семикратным интервалом времени сразу после кондиционирования. Перенесите оставшуюся популяцию червей на 100-миллиметровые чашки с HGM, содержащие 1 мл OP 50.

Снова нанесите от 100 до 200 мкл суспензии червей на каждую чашку, чтобы обеспечить достаточное количество бактерий для поддержания популяции. Инкубируйте чашки после кондиционирования при 20 °C в течение 16, 24 или 40 часов, что соответствует временным точкам долговременной ассоциативной памяти, для проверки долговременной ассоциативной памяти на связь между пищей и бутанолом. Осторожно смойте червей с чашек в коническую пробирку объемом 15 мл, повторив процедуру один или два раза с использованием буфера M9 после каждой временной точки, и протестируйте червей с помощью анализа хемотаксиса.

Для подготовки планшетов для анализа хемотаксиса отметьте на дне неиспользованных 100-миллиметровых чашек с NGM-средой три точки у края, как показано здесь. Нанесите 1 µL 1 M азида натрия в точки для аттрактанта и контроля. Сделайте это не ранее чем за 15 минут до начала анализа, чтобы минимизировать диффузию парализующих агентов.

Затем нанесите по 1 µL 95% ethanol и 10% butone на соответствующие лунки промаркированного планшета для анализа, поверх ранее нанесенного sodium azide. Удалите из пробирки с осевшими червями максимально возможный объем буфера M nine.

Используя дозатор P 20 с обрезанным кончиком, нанесите 15 µL суспензии червей на стартовую линию планшета для анализа, распределив объем тремя порциями по 5 µL. Затем скрутите угол салфетки Kimwipe в острый кончик и с его помощью удалите излишки буфера M9, стараясь не повредить агар.

Удаление избытка буфера позволяет червям переместиться на планшет для анализа. Если для подсчета червей используется визуализация, изображение точки старта сразу после этого перемещения позволит определить общее количество животных на планшете для анализа. Инкубируйте планшет для анализа хемотаксиса в течение одного часа при комнатной температуре после инкубации, затем подсчитайте количество червей в точках старта, в пятнах этанола и бутона, а также общее количество червей на планшете для анализа.

Как правило, черви, парализованные азидом натрия, располагаются в радиусе одного сантиметра от капель и выглядят полностью выпрямленными. Поскольку многие особи скапливаются друг с другом, червей можно подсчитать вручную или количественно оценить с помощью программного обеспечения для визуализации и анализа. Для упрощения процесса и обеспечения достоверности результатов мы предпочитаем последний метод.

После количественного подсчета червей в исходных пятнах этанола и бутонона рассчитайте индекс KeyAx, как показано здесь. Типичный индекс наивного хемотаксиса для червей дикого типа, реагирующих на 10% Butone, составляет около 0,2. Массовое или разнесенное обучение обычно повышает индекс хемотаксиса до 0,7–0,8 в момент времени ноль, что дает индекс обучения около 0,6.

Первичный хемотаксис крайне чувствителен к условиям содержания червей. На данном рисунке показана заметная разница в индексе хемотаксиса (CI) между сытыми и голодающими первичными червями, что подчеркивает важность соблюдения правильной техники. Сохранение памяти отражается во времени, за которое индекс хемотаксиса возвращается к исходному уровню при значении индекса обучения, равном нулю, у животных дикого типа.

Краткосрочная ассоциативная память начинает угасать через один час после массового обучения, которое длится около двух часов, и, по сравнению с долгосрочной, не зависит от фактора транскрипции Creb. Долгосрочная ассоциативная память обычно не начинает значительно угасать до 16 часов после пространственного обучения, которое может длиться до 40 часов, и зависит от Creb. При выполнении данной процедуры важно помнить, что на анализы хемотаксиса могут повлиять голодание или избыток запахов в окружающей среде, а также что память и состояние червей могут быть нарушены слишком сильным физическим воздействием.