Несколько мыши нейроанатомической Магнитно-резонансная томография

Общая цель данной процедуры заключается в обеспечении высокопроизводительного фенотипирования живых или фиксированных мышей с помощью многократной МРТ головного мозга мышей. Для этого сначала каждую мышь вводят в состояние наркоза. Затем для сканирования in vivo каждую мышь помещают на подходящий по размеру салазки, после чего устанавливают в загрузочный массив и позиционируют в апертуре магнита.

Либо для визуализации ex vivo выполните транскардиальную перфузию, изолируйте структуру черепа и поместите её в трубки для визуализации, которые затем устанавливаются в 16-канальную систему соленоидных катушек, расположенную в апертуре магнита. В конечном итоге можно получить трехмерные объемы магнитно-резонансной томографии с высококачественными изображениями мозга, подходящими для фенотипирования основных и второстепенных структур мозга мыши. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как гистология, является сохранение общей анатомии образцов непосредственно в черепе, что обеспечивает охват всего мозга и возможность трехмерного анализа.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биомедицины, такие как взаимосвязь между генами и анатомическими особенностями, которые представляют собой фенотипы в мышиных моделях заболеваний. Как правило, лицам, впервые осваивающим эту технику, потребуется разработка специализированных катушек для позиционирования мышей и массивов радиочастотных катушек, необходимых для высокопроизводительной визуализации головного мозга. Самым сложным этапом является идентификация и взвешивание. Перед началом выполнения данного протокола получите разрешение на все процедуры по обращению с животными в комитете по уходу за животными вашего учреждения, институциональном комитете по уходу и использованию животных или аналогичном органе.

Записи данных животных следует проводить в шкафу биологической безопасности. Затем перенесите животных в автоклавируемый пластиковый контейнер для транспортировки в камеру индукции МРТ. Проведите анестезию животных, предназначенных для сканирования, в предварительно прогретой камере индукции, используя 4% ISO fluorine и кислород со скоростью потока четыре литра в минуту.

Животные считаются полностью анестезированными, когда они перестают реагировать на зажим лапы. При необходимости шерсть на груди можно удалить с помощью триммера, например nare, для обеспечения лучшего контакта с ЭКГ и устройствами мониторинга температуры, встроенными в специальную санную платформу. Также нанесите в глаза ИВВ, например tears natural PMM, для предотвращения пересыхания и введите подкожно примерно 0.3 milliliters физиологического раствора.

Для гидратации животных. Теперь поместите мышей на индивидуальные сани со встроенными датчиками ЭКГ, дыхания и температуры. Осторожно расположите передние и задние конечности в соответствующих углублениях на санях.

В случаях, когда требуется ЭКГ-мониторинг, убедитесь, что безволосые участки на брюшной стороне мыши совпадают с электродами ЭКГ, зафиксируйте каждое животное с помощью головного и носового ремней, затем поместите каждую платформу в открытую коническую пробирку объемом 50 milliliter. За один сеанс визуализации можно подготовить до семи живых мышей. Затем установите конические пробирки в загрузочный массив.

Убедитесь, что все линии физиологического мониторинга подключены после того, как все животные будут размещены. Установите уровень изофлурана в апертуре магнита на 2%, а уровень подачи кислорода — на 8 литров в минуту. Теперь переместите массив для загрузки к магниту и установите его на рельсовую систему.

Используйте систему направляющих, чтобы соединить загрузочный массив с «мушиным ульем» (mouse hive), который предназначен для равномерного позиционирования мышей в каждой радиочастотной катушке, расположенной в центре апертуры магнита. При полном введении в магнит центрифужные пробирки стыкуются с системой подачи анестетика внутри РЧ-катушек, как показано здесь; смесь ISOF-фтора с кислородом подается из «мушиного улья» образцу через трубку, проходящую вдоль оси каждой отдельной катушки. Эта смесь анестезирующего газа поступает в пробирки мимо мышей и собирается активным блоком очистки, прикрепленным к задней части загрузочного массива.

В зависимости от физиологических показателей животных, таких как дыхание и температура, уровень изофлурана следует установить в диапазоне от 0,9 до 2%. Теперь проведите сканирование животных с использованием последовательности быстрого спинового эха. Продолжительность каждого трехмерного сканирования составляет примерно три часа, при этом результирующее разрешение изображения составляет 125 микрометров. Обязательно контролируйте показатели ЭКГ, дыхание и температуру каждого животного на протяжении всего процесса сканирования.

Во время сеанса сканирования животных также следует поддерживать в тепле, используя поток подогретого воздуха. По завершении сканирования извлеките загрузочную кассету из магнита и поместите ее в теплую индукционную камеру, заполненную 100% кислородом. Извлеките животных из трубок и перенесите их в герметичные пластиковые контейнеры для транспортировки в бокс биологической безопасности.

Наконец, поместите животных в теплую клетку, защищенную от сквозняков, и дайте им восстановиться после анестезии для проведения exvivo визуализации животных. Сначала полностью анестезируйте животных путем внутрибрюшинного введения комбинации кетамина и ксилазина. Перед началом перфузии оцените глубину хирургической анестезии с помощью щипка за палец или лапу.

Вскройте грудную клетку и введите иглу или безопасную winged infusion set (систему с «крылышками») в левый желудочек сердца. Затем разрежьте правое предсердие, чтобы начать транскардиальную перфузию. Сначала промойте орган 30 миллилитрами фосфатно-солевого буферного раствора (1x PBS) комнатной температуры, смешанного с гепарином в концентрации 1 µL/mL и 2 mM протеазы, используя скорость потока примерно 100 mL/h.

Это должно занять около 20 минут. Следующий этап фиксации проводится с использованием 30 мл 4% параформальдегида комнатной температуры, смешанного с 2 мМ проназе, при скорости потока 100 мл/ч. Теперь обезглавьте животное и удалите кожу, нижнюю челюсть, ушные раковины и хрящевую часть кончика носа.

Затем поместите оставшуюся структуру черепа в 4% параформальдегид, смешанный с 2 мM ProHand, и оставьте на ночь при температуре 4 °C. На следующий день перенесите образец в раствор 1x фосфатно-солевого буфера, смешанного с 0,02% азидом натрия и 2 мM ProHand для консервации. МРТ-сканирование с высоким разрешением в 3D при 7 Тесла должно быть проведено в течение как минимум четырех дней, но не более чем через два с половиной месяца.

После перфузии поместите образцы мозга, предназначенные для визуализации, в 16-канальную систему соленоидных катушек и установите её в сканер. Затем проведите сканирование образцов с использованием последовательности быстрого спинового эха.

Продолжительность этого сканирования составляет приблизительно 12 часов, и итоговые изображения будут иметь изотропное разрешение 32 мкм. После завершения сканирования извлеките образцы из катушки для визуализации и поместите каждый череп в 10%-ный раствор формалина с 2 мМ про-рук для сохранения вида, соответствующего состоянию in vivo. Здесь представлены несколько изображений мозга мыши, полученных в ходе одного трехчасового сканирования.

На этом рисунке показаны три оси просмотра для каждой из семи просканированных мышей. Здесь представлено репрезентативное изображение мозга ex vivo с изотропным разрешением 32 микрона. А здесь мы видим 3D-визуализацию объема изображения ex vivo после обработки.

Эта методика in vivo может быть выполнена за три-четыре часа при условии правильного проведения. Данный метод может использоваться исследователями во многих биомедицинских областях для изучения таких заболеваний, как системная красная волчанка, болезнь Гентингтона и болезнь Альцгеймера, на мышиных моделях. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить визуализацию как живых, так и фиксированных образцов большинства объектов для получения высококачественных изображений мозга с помощью МРТ.

Спасибо за просмотр.