Выделение Перевод Рибосомы содержащих пептидил-тРНК на функциональные и структурные анализы

Общая цель следующего эксперимента заключается в анализе структуры и функции чистых рибосом, содержащих уникальную пептидилтРНК. Это достигается путем проведения анализов трансляции in vitro с использованием бесклеточных экстрактов, обедненных факторами высвобождения, и мРНК, меченных биотином, для получения комплексов рибосом с заторможенной пептидилтРНК, прикрепленных к меченным биотином мРНК. На втором этапе парамагнитные бусины, связанные со стрептавидином, смешивают с реакционной смесью для трансляции in vitro, чтобы обеспечить их взаимодействие с молекулами биотина, расположенными в мРНК.

Затем с помощью магнитных полей из общей реакционной смеси извлекают гранулы, к которым прикреплены заблокированные комплексы пептид-тРНК-рибосома, связанные с мРНК. Далее очищенные комплексы пептид-тРНК-рибосома можно смешать с факторами трансляции, такими как факторы терминации трансляции, ингибирующими антибиотиками или химическими модифицирующими агентами для анализа их функции. В результате исследования ингибирования и структуры рибосомы получены данные, демонстрирующие подавление гидролиза пептид-тРНК и его корреляцию со структурными изменениями в рибосомах на основании активности пептидилтрансферазы или анализов терминации трансляции с использованием SDS- или Tris-Racine электрофореза в ПААГ, а также анализов защиты от модификации с использованием электрофореза в ПААГ с мочевиной.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как дифференциальное центрифугирование, является то, что выделенные образцы содержат преимущественно рибосомы с одной популяцией пептидил-тРНК. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области экспрессии генов, таких как природа растущих полипептидных цепей и влияние антибиотиков на функцию рибосом, например, путем модуляции процесса трансляции. Для начала данной процедуры получите два грамма сухого осадка бактерий e coli из культур, находящихся в логарифмической фазе роста.

Промойте осадок, ресуспендировав его в одном литре буфера, с последующим центрифугированием при 5 000 G в течение пяти минут при температуре four degrees Celsius. После проведения двух промывок ресуспендируйте полученный бактериальный осадок в 40 миллилитрах буфера и разрушьте бактериальные клетки с помощью французского пресса, приложив давление 6 000 PSI. Данное давление соответствует 600 единицам при использовании поршня диаметром one inch.

Соберите гомогенизированную суспензию в чистую стеклянную пробирку объемом 50 миллилитров. Обработайте суспензию 1 мМ DIO-триолом или DTT, затем центрифугируйте образец при 30 000 G в течение 30 минут. Удалите полученный супернатант и повторите процедуру центрифугирования.

Сохраните супернатант, полученный после второго центрифугирования, и разлейте финальный супернатант по микропробиркам. В завершение подвергните аликвоты шоковой заморозке, используя смесь сухого льда с этанолом или жидкий азот, и храните образцы при температуре -60 или -80 градусов Цельсия.

Начните приготовление бесклеточных экстрактов, обедненных RF two, смешав 4,5 milliliters суспензии бусин protein A spheros four B с пятью milliliters антисыворотки к RF two. Перемешивайте смесь на ротаторе при комнатной температуре в течение одного часа. Центрифугируйте смесь при 2, 500 Gs, чтобы отделить бусины от антисыворотки.

Удалите супернатант. Теперь гранулы содержат антитела anti RF two и будут называться гранулами anti RF two. Промойте гранулы, ресуспендировав их в 1 мл буфера bee.

Затем центрифугируйте гранулы, как и прежде, чтобы отделить гранулы с анти-RF2 от буфера B. Повторите процедуру промывки дважды. После промывки гранул смешайте 1 мл бесклеточного экстракта со 150 µL гранул с анти-RF2 и инкубируйте на ротаторе при 4 °C в течение двух часов. Центрифугируйте смесь при 10 000 ×g, чтобы отделить бесклеточный экстракт от гранул.

Удалите супернатант и повторно обработайте его еще 150 µL бусин anti RF two, после чего снова проведите инкубацию и осаждение. Разлейте итоговый раствор бесклеточного экстракта, обедненного RF two, по микропробиркам по 100 µL в каждую. Заморозьте аликвоты, используя смесь сухого льда с этанолом или жидкий азот, и храните при температуре -60 или -80 °C.

Подготовьте ПЦР-реакцию, объединив плазмидную матрицу, содержащую целевые последовательности, олигодезоксинуклеотиды, dNTP, интактную ДНК-полимеразу и специализированный ПЦР-буфер. После подготовки образца проведите реакцию амплификации, затем осадите ДНК для очистки продуктов ПЦР, добавив 1/10 объема 3 M ацетата натрия (pH 5.2) и два объема ледяного этанола. После повторного проведения процедуры осаждения полученную ДНК ресуспендируют в 100 µl деионизированной или дистиллированной воды.

Проверьте целостность продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозных гелях. Обычно в результате этой процедуры получается 100 µg продукта ДНК длиной 600 bp. Приготовьте реакционную смесь для транскрипции in vitro объемом 100 µL в деионизированной воде, смешав 5 µg фрагмента ДНК, полученного методом ПЦР, с рибонуклеотидами, биотинилированным UTP и смесью фермента T7.

Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение трех часов. Чтобы количественно определить количество полученной мРНК, удалите матричную ДНК, добавив РНК-бесплазмидную ДНКазу. Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 10 минут.

Для очистки продуктов мРНК осадите РНК дважды, добавив 1/10 объема трехмолярного ацетата натрия с pH 5.2 и два объема холодного этанола; ресуспендируйте осажденную мРНК в 100 µL воды, обработанной DEPC. Проверьте целостность меченой биотином мРНК с помощью электрофореза в агарозных гелях. Обычно в результате данной процедуры получается от одного до двух миллиграммов продукта мРНК длиной 600 нуклеотидов, меченого биотином. Для начала выделения транслирующих рибосом, содержащих пептид-тРНК, в воде, обработанной DEPC, готовят 500 µL смеси для трансляции in vitro.

Сначала приготовьте буферизированную реакционную смесь, описанную в прилагаемом письменном протоколе, затем добавьте по 75 M каждой аминокислоты, за исключением той, которая будет заменена радиоактивной аминокислотой. Далее добавьте от 20 до 50 µL бесклеточного экстракта клеток, обедненного RF2, в буферный раствор с аминокислотами. Инкубируйте смесь в течение пяти минут при комнатной температуре для активации рибосом.

После активации рибосом добавьте в образец от 10 до 15 µg мРНК, меченных биотином. Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 10 минут.

Тем временем приготовьте три миллилитра парамагнитных бусин со стрептавидином или SMB в буфере C. После инкубации добавьте суспензию SMP в реакционную смесь для трансляции. Инкубируйте полученную суспензию при комнатной температуре в течение 10 минут. Отделите SMB от смеси, приложив магнитное поле с помощью штативов для магнитного разделения. Ресусп.

Суспендируйте SMB в буфере C и снова отделите гранулы с помощью магнитного штатива. Повторив процедуру промывки дважды, ресуспендируйте гранулы в 500 µL буфера C. Храните суспензию на льду и немедленно переходите к следующему этапу. Для визуализации peptid TRNA смешайте 10 µL суспензии SMB в буфере C с 10 µL буфера для нанесения, затем разделите компоненты, связанные с гранулами, путем электрофореза образцов в 10% Tris-tric полиакриламидных гелях.

Высушите гели с помощью вакуумного сушителя для гелей. Затем проверьте целостность и чистоту пептидной TRNA, экспонировав высушенный гель на рентгеновскую пленку. Для анализа рибосомной РНК смешайте 190 µL 2 mM раствора EDTA, приготовленного на воде, обработанной dpci, 200 µL фенола, уравновешенного водой, и 10 µL суспензии бусин.

Перемешайте полученную суспензию с помощью интенсивного вортексирования. Отделите неорганическую фазу от органической фазы путем центрифугирования при 10,000 Gs в течение трех минут. При комнатной температуре соберите верхний водный слой в новую микропробирку, осадите РНК из водного слоя, добавив 1/10 объема 3 М ацетата натрия (pH 5.2), 1 µl раствора гликогена (20 mg/mL) и два объема ледяного этанола. Ресуспендируйте осажденную РНК в 10 µl воды, обработанной DEPC.

Проверьте целостность рибосомных РНК с помощью электрофореза в нироза-гелях. Обычно 50 µL суспензии после гомогенизации в бид-битере позволяет получить один мкг рибосомной РНК. Здесь представлены результаты серии анализов, оценивающих качество и функциональность выделенных транслирующих рибосом.

Наблюдение уникальной полосы, разделенной в полиакриламидных гелях, указывает на наличие полипептидов, связанных с мечеными биотином мРНК, прикрепленными к SMB. Очистка рибосомальных РНК с использованием данной процедуры подтверждает также наличие рибосом, связанных с этими мечеными биотином мРНК.

Добавление пуромицина — антибиотика, индуцирующего пептидилтрансферазную активность рибосомы, — приводит к расщеплению нативных пептидил-тРНК. Это проявляется в виде сдвига профиля миграции изолированного полипептида в полиакриламидных гелях. В совокупности эти данные указывают на то, что меченные биотином мРНК, прикрепленные к SMB, содержат функциональные рибосомы с пептидил-тРНК.

Выделение транслирующих рибосом, содержащих специфические пептидил-тРНК, позволяет изучать влияние пептидил-тРНК, антибиотиков и других молекул на функцию и структуру рибосом. В представленных здесь примерах антибиотик парсамимин и аминокислота триптофан ингибируют гидролитическое расщепление нативной пептидил-тРНК TNAC фактором RF2 в изолированных рибосомах.

Взаимодействие триптофана или спарсмицина с рибосомой также вызывает структурные изменения в некоторых нуклеотидах, составляющих 23 S-РРНК транслирующей рибосомы. После освоения основ данную технику можно выполнить за пять часов при условии надлежащего соблюдения процедур. Для получения дополнительных ответов на вопросы о структуре рибосомы, содержащей уникальные пептиды и РНК, могут быть применены другие методы структурного анализа, такие как криоэлектронная микроскопия.