ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Подготовка Коллагеназа <ol><li> Отвешивать коллагеназы в 50 мл конические и добавить изоляции буфера, чтобы конечная концентрация, как указано в таблице ниже. Растворите коллагеназы на вортексе. (12 мышей + 2 дополнительных мышей = 14 мышей х 5 мл / мышь = 70 мл полное решение коллагеназы) (70 мл х 0,5 мг / мл или 0,3 мг / мл = 35 мг или 21 мг общего коллагеназы Р) <table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%"><tbody><tr><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Напряжение </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Возраст </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Коллагеназа Р (мг / мл) </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Время (мин) </th></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / С, В6 </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 недель </td><td style="font-size: 12px"> 0,8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / С, В6 </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 недель </td><td style="font-size: 12px"> 0,5 </td><td style="font-size: 12px"> 13 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NOR, ОТСУТСТВИЯ </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 недель </td><td style="font-size: 12px"> 0,8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NOR, ОТСУТСТВИЯ </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 недель </td><td style="font-size: 12px"> 0,5 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr></tbody></table> </li><li> Внесите 2 мл коллагеназы раствора в каждую ампулу стекла и место на льду. Нагрузка каждого 5-мл шприц 3 мл коллагеназы добавить иглой 30g и место в лед (подготовка в капот). </li></ol> Растяжение <ol><li> Незадолго до вскрытия, жертву животного шейки дислокации. Спрей всего тела с 70% этанола, что делает его совершенно мокрый. Сделать V-insision, начиная с области половых органов. Поверните мышь так хвост отворачивается от вас. </li><li> Удалить кишечника в левой части открытой мыши. Это выставит поджелудочной железы и общего желчного протока. </li><li> Место кровоостанавливающего зажима на обе стороны тонкой кишки, где желчных протоков стоков, оставляя небольшой карман для коллагеназы решение войти в кишечнике. </li><li> Inflate поджелудочной железы через желчный проток с иглой 30g и 5 мл шприц, содержащий 3 мл холодного раствора коллагеназы, начиная с желчным пузырем. </li><li> Удаление поджелудочной железы из тела и поместить его в силиконизированный флакон с 2 мл коллагеназы решение. Этот шаг должен быть сделан быстро и чисто, как это возможно, сведения к минимуму сбор жира и соединительной ткани. </li><li> Место флакон на льду и повторите шаг 3 со следующей мыши. </li></ol> Пищеварение <ol><li> Печать каждого флакона и поместить его в 37 ° С водяной бане. Инкубируйте 13-17 минут (время варьируется в зависимости от штамма и возраста животного). </li><li> После истечения времени, встряхнуть флакон энергично. Поджелудочной железы должны разваливаться. </li><li> Залить каждую переварить через большую стерильной фильтр погрузиться в стерильную 1000 мл стакан и с силой пипетки с экрана промывочным раствором. Внесите дайджесты в 50 мл пробирки conicals (3 pancreata/50 мл трубки: при п = 12, достаточно использовать промывочный буфер, чтобы сделать окончательный объем 200 мл и отказаться от ее 4x50 мл пробирки). Разбавление должно быть сделано быстро и на льду, чтобы избежать нежелательных пищеварения островок. </li><li> Спином вниз: Пуск центрифуги. Когда она достигает 1300 оборотов в минуту, выключить его. </li><li> Аспирируйте супернатант, оставив ~ 5 мл. Будьте очень осторожны, чтобы не аспирата гранул. </li><li> Ресуспендируют гранул, нажав энергично рукой, а затем добавить 50 мл промывочного буфера. </li><li> Спином вниз: Пуск центрифуги. Когда она достигает 1300 оборотов в минуту, выключить его. </li><li> Ресуспендируют шарик и промыть 5 мл промывочного буфера. </li><li> Передача 5 мл до 15 мл конические и спином вниз, как указано выше. </li><li> Аспирируйте супернатант как можно более полно. (Оставшееся буфера может привести к изменению плотности Ficoll.) </li></ol> Ficoll Выполнить быстро. Долгосрочные Ficoll экспозиции является токсичным для островков. <ol><li> Убедитесь, что гранулы полностью разбит перед добавлением Ficoll (непрерывную ткань трудно ресуспендируют в Ficoll). </li><li> Ресуспендируют гранул в 7 мл Ficoll, плотность 1,108, по вортексе энергично. </li><li> Слой друг на плотность Ficoll 2 мл каждого из оставшихся плотности в таком порядке: 1,096, 1,069, то 1,037. </li><li> Спиновые в течение 15 минут при 1800 оборотов в минуту на 4 градуса, с перерывом OFF! </li><li> Выберите островки из второй слой с помощью spoid (стерильный рlastic пипетки). Передача всех коллекций в 50 мл конические, содержащей ~ 25 мл холодного буфера. </li><li> Вымойте, как и выше, в 3 раза промывочным буфером (повторив шаг 12-15). </li><li> Ресуспендируют островков в 20 мл RPMI-1640 (содержащей 10% FCS и пенициллин и стрептомицин, HEPES, MEM-NEAA) и аккуратно перемешать. Удалить 100 мкл образца для подсчета голосов. </li><li> Передача 100 мкл до 35 мм грид-пластину, содержащую 1 мл среды и 1 мл дитизоном. </li><li> Инкубируйте оставшиеся островки в RPMI 1640 году, в 37 ° C, 7% СО 2 инкубатора, в 160 мм пластин с в общей сложности 30 мл среды / пластину. <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="Рисунок 1" width="220" height="194" /></li></ol>

Изоляция мышей Островок поджелудочной железы

Murine Pancreatic Islet Isolation

Здравствуйте, я Грег Зотт из лаборатории Блустоуна Центра диабета UCSF. Сегодня я продемонстрирую вам процесс изоляции островков Лангерганса мыши. Процедура включает введение раствора коллагеназы в поджелудочную железу мыши-донора линии C3H, после чего мы извлечем поджелудочную железу, проведем ее ферментативное переваривание, очистим островки с помощью градиента Фиколла и затем вручную отберем их для последующей трансплантации в капсулу почки диабетической мыши линии NOD, которая будет выступать в качестве реципиента.Перед началом данной процедуры мы развели раствор ATE в модифицированном буфере Хэнкса и скорректировали концентрацию специально для используемой нами линии мышей C3 H. Мы определили, что более эффективный лизис достигается при использовании раствора коллагеназы с концентрацией 0,8 mg/mL, который мы будем вводить в общий желчный проток для растяжения поджелудочной железы. Процедуру сегодня будет проводить Паво Кодре из центра диабета. Он вскроет мышь, обнажит кишечник и произведет инъекцию в общий желчный проток.Мы опрыскаем мышь этанолом, чтобы пригладить шерсть, а затем проверим, была ли мышь правильно усыплена, с помощью щипка за палец. Теперь Паво вскроет мышь, обнажив кишечник и поджелудочную железу с помощью срединного разреза. Диафрагма также будет рассечена для подтверждения того, что животное мертво.Прежде чем мы начнем, я хотел бы указать на некоторые важные структуры. Желудок расположен здесь; под ним прилежит поджелудочная железа, переходящая в двенадцатиперстную кишку. Это печень, где расположены желчный пузырь и общий желчный проток, который вы видите прямо здесь.Далее Паво изолирует тонкую кишку и найдет место впадения общего желчного протока в тонкую кишку. После обнажения кишки мы накладываем зажимы-москиты по обе стороны от общего желчного протока. Мы обнаружили, что такой подход позволяет большему количеству коллагенатов проникать в поджелудочную железу, в то время как в других группах пытаются наложить зажим непосредственно на общий желчный проток.Мы обнаружили, что данный метод более эффективен для обеспечения проникновения фермента в поджелудочную железу. Это щадящая процедура. Важно избегать разрывов кишечника.Необходимо расположить зажимы так, чтобы они аккуратно прилегали к обеим сторонам общего желчного протока. Теперь найдем желчный пузырь; как только он будет обнаружен, мы используем его в качестве ориентира для введения коллагеназы в общий желчный проток. Пауэлл использует иглу 30G и шприц объемом 5 cc, содержащий 3 мл раствора коллагеназы.При введении в общий желчный проток он расширяет этот проток раствором коллагеназы, затем продвигается по общему желчному протоку до области, прилегающей к кишечнику. По мере продвижения растворы ферментов закачиваются в поджелудочную железу. После того как поджелудочная железа будет заполнена раствором коллагеназы, Пауэлл снимет гемостаты, а затем аккуратно извлечет поджелудочную железу из организма мыши, осторожно отделяя ее от кишечника.Он извлекает его из желудка. Затем, используя селезенку в качестве зажима, он приподнимает поджелудочную железу и медленно перерезает ее в области общего желчного протока. Поджелудочная железа отделена, после чего удаляется селезенка. Затем он удаляет брыжеечную ткань, после чего поджелудочная железа помещается в стерильный стеклянный флакон с раствором коллагеназы 2 mg/mL и снова ставится на лед.Изолированную поджелужечную железу, помещенную в стеклянные флаконы, теперь следует поместить в водяную баню при температуре 37 °C примерно на 17 минут. Мы поместили их в конический штатив объемом 50 мл, чтобы флаконы не всплывали. С этого момента запускается таймер и начинается процесс переваривания.По завершении времени дигестии пробирки извлекают, затем осторожно встряхивают для разрушения образца. Как только ткань начинает распадаться, пробирку помещают на лед. Над стаканом объемом 400 мл, содержащим промывочный буфер, устанавливают стерильное сито.Затем дигестат поджелудочной железы осторожно переливают через сито в промывочный буфер. В демонстрационных целях вытяжной шкаф был выключен, а его стеклянная панель поднята, чтобы был виден процесс. После того как дигестат поджелудочной железы перелит в стакан, пробирки промывают тем же промывочным буфером, и этот буфер также сливают через сито.У нас есть шприц, заполненный промывочным буфером. Мы будем использовать его для интенсивного промывания ткани через сито. Цель состоит в том, чтобы удалить все свободные глазчатые структуры, не прикрепленные к матриксу, оставив при этом мембраны и непереваренную ткань на сите.После завершения промывки ткани результат обычно выглядит так, как показано в конце процедуры. Ткань поджелудочной железы, находящуюся на дне пробирки, теперь переносят в две конические пробирки объемом 50 мл; ткань промывают, равномерно перемешивают, а затем распределяют так, чтобы в каждой пробирке был одинаковый объем осадка. Стакан теперь промывают дополнительным промывочным буфером.Стенки промывают, чтобы весь перенесенный в стакан материал снова попал в раствор. Затем содержимое равномерно распределяют между двумя коническими пробирками по 50 мл. После этого пробирки доверху заполняют промывочным буфером.Ткань несколько раз переворачивают, после чего помещают в центрифугу. Проводится кратковременное центрифугирование. Центрифугу разгоняют до 1000 RPM, а затем выключают.В данный момент ткани очень чувствительны, и не следует подвергать их чрезмерному уплотнению. Пробирки извлекают, и этот этап промывки повторяют еще трижды. Это завершение третьей промывки.Содержимое конической пробирки объемом 50 мл переносят в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 1000 rpm, после чего центрифугирование прекращают. Супернатант удаляют, и начинают первую часть протокола FI Call. На данном этапе мы имеем осадок дигеста поджелудочной железы.Мы ресуспендируем ткань, чтобы она была достаточно однородной и не слипалась в агрегаты. Затем мы добавим первый градиент плотности 1.108. В каждую пробирку добавим по 5 мл.Затем осадок тщательно перемешивают в каждом из градиентов. Важно обеспечить хорошее распределение ткани в самом тяжелом градиенте. Теперь мы нанесем слоем 2 мл раствора с плотностью 1,096.Затем поверх этого мы нанесем слой плотностью 1.069 толщиной две тысячих дюйма, а затем слой плотностью 1.037. Важно, чтобы при наслоении различных плотностей они не смешивались. Теперь все слои добавлены в пробирку.И вы видите верхнюю часть пробирок 1108, 91096, 1069 и 1037. Видно, что ткань уже начинает перемещаться к своей расчетной плотности даже без центрифугирования. Градиенты в пробирках доводят до рабочей скорости при 1800 RPM в течение 15 минут; помните, что после извлечения пробирок из центрифуги тормоз должен быть выключен.Между слоями 0 0 9 6 и 0 0 7 видна четкая полоса ткани островков. Теперь удаляют слой 0 3 7, чтобы убрать любые остатки тканей и ДНК, которые могли высвободиться в процессе обработки. Используя стерильную пластиковую пипетку-пастер, Пабло удаляет слой островков и переносит их в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 25 мл промывочного буфера.Этот этап следует выполнить быстро, так как fol токсичен для островков. Мы фактически удалили весь слой 0 6 9 и 0 9 6. Паво отрезает верхнюю часть пластиковой пастерновской пипетки и промывает ее промывочным буфером.Затем глазные яблоки центрифугируют так же, как и в предыдущий раз. Скорость центрифугирования доводят до 1000 RPM, после чего центрифугу останавливают и аспирируют супернатант. Глазные яблоки промывают трижды в промывочной среде.Таким образом, мы завершили процесс изоляции островков: от переваривания через градиент плотности до получения очищенных островков. После третьей промывки промывочным буфером мы ресуспендировали островки в среде RPMI и перенесли их в планшет для культивирования тканей. Теперь эти островки готовы для проведения анализов in vitro или подготовки к процедурам in vivo, таким как трансплантация островков.

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Достижение высокого качества и соответствующего количества человеческих островков является одним из видных предпосылки для успешной трансплантации островок. В этом видео мы опишем шаг за шагом процедуры человеческой изоляции островков поджелудочной железы (часть I: пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы), с помощью модифицированного метода автоматизированного.

Изоляция человека Островок поджелудочной железы: Часть I: Пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы

Достижение высокого качества и соответствующего количества человеческих островков является одним из видных предпосылки для успешной трансплантации островок. В этом видео мы опишем шаг за шагом процедуры человеческой изоляции островков поджелудочной железы (часть II: очищение и культуре человеческих островков) с помощью модифицированного метода автоматизированного.

Изоляция человека Островок поджелудочной железы: Часть II: Очистка и культуры прав Островки

Подробное описание изоляции мыши островка описывается с помощью техники на месте панкреатического протоков катетеризации и перфузии сочетание очищенной коллагеназы и нейтральной протеазы.

Мышь Островок Лангерганса изоляции с использованием комбинации Очищенный коллагеназы и нейтральной протеазы

Островки поджелудочной железы, также называемые островками Лангерганса, представляют собой скопление эндокринных клеток, которые вырабатывают гормоны для регуляции глюкозы и других важных биологических функций. Этот протокол объясняет метод выделения островков поджелудочной железы путем первичной перфузии коллагеназы через ампулу Фатера для переваривания экзокринной ткани поджелудочной железы и упрощенного центрифугирования градиента плотности для очистки островков от мышей.

Выделение островков поджелудочной железы с помощью перфузии коллагеназы: ферментативный метод выделения островковых клеток поджелудочной железы

Мы представляем здесь протокол выделения островков из мышиной модели диабета 2 типа, Leprdb и детали анализа живых клеток для измерения секреции инсулина из интактных островков, который использует 2-фотонную микроскопию.

Lepr<sup&gt; ДБ</sup&gt; Мышь Модель сахарного диабета 2 типа: поджелудочной Островок изоляции и живых клеток 2-Фотон изображений интактных островков

Критические проблемы для области исследования диабета должны понять молекулярные механизмы, которые регулируют репликацию β-клеток островков и разработать методы стимуляции регенерации β-клеток. При этом метод высокого содержания скрининга для выявления и оценки репликации способствующего активности β-клеток малых молекул представлена.

Высокая-контент<em&gt; In Vitro</em&gt; Панкреатическими островками β-клеток репликации Discovery Platform

Мы опишем протокол в настоящем документе для выделения интактные островки из неонатальных мышей. Поджелудочных желез частично переваривают коллагеназы, с последующим промыванием и ручного сбора. 20 - 80 островковых кластеры могут быть получены в поджелудочной железе от новорожденных мышей, которые подходят для нескольких островковых исследований.

Эффективная изоляция функциональных островках из неонатальной мыши Поджелудочная железа

Этот протокол изоляции островка описал новый маршрут инъекции коллагеназы для переваривания экзокринной ткани и упрощенную процедуру градиента для очищения островков от мышей. Она включает в себя ферментативное пищеварение, градиент разделения / очистки, и на кашет ручной сбор. Успешная изоляция может дать 250-350 высококачественных и полностью функциональных островков на мышь.

Простой протокол высокой эффективности для изоляции поджелудочной железы от мышей

Здесь мы представляем протокол изолировать клетки поджелудочной островок мыши для скрининга ROS индукции, ксенобиотиков с целью выявления потенциальных diabetogenic ксенобиотиков химических веществ.

Cell-based скрининга мышиных поджелудочной островок Diabetogenic окружающей среды химических веществ

Здесь мы представляем протокол для визуализации и количественной оценки динамики кальция в неоднородных популяциях клеток, таких как клетки островков поджелудочной железы. Флуоресцентные репортеры поставляются в периферийный слой клеток внутри наиксхота, который затем обездвиживается и образуется, и на одного клетка проводится анализ динамики интенсивности флуоресценции.

Изображение динамики кальция в субпопуляциях мышей поджелудочной железы клеток на икры

В этом исследовании был разработан упрощённый метод эффективного извлечения функциональных первичных островков и ацинарных клеток из поджелудочной железы мышей, предоставляя ценный инструмент для изучения межклеточной коммуникации в патогенезе острого диабета, вызванного панкреатитом.

Простой и быстрый метод одновременного выделения первичных островков и первичных ацинарных клеток поджелудочной железы у мышей

Узнайте метод изоляции островков поджелудочной железы у мышей с использованием коллагеназы и градиента Ficoll для трансплантации диабетическим реципиентам. Этот подход помогает исследователям изучать функцию островков и разрабатывать новые стратегии лечения диабета.

Изоляция мышей Островок поджелудочной железы

Больше видео