Изоляция мышей Островок поджелудочной железы

Привет, меня зовут Грег Зотт. Я работаю в Центре диабета Калифорнийского университета в Сан-Франциско в лаборатории Блюстоун, и сегодня я покажу вам процесс выделения глазков мыши. Процедура включает в себя инъекцию раствора коллагеназы в поджелудочную железу донорской мыши C3 H, где мы затем удаляем эту поджелудочную железу, перевариваем ее, очищаем глазницы на фиальном градиенте, а затем вручную отбираем их для окончательной трансплантации в почечную капсулу диабетической мыши NOD, которая будет нашим реципиентом.

Прежде чем начать эту процедуру, мы разбавили наш раствор ATE в модифицированном буфере Хэнкса и отрегулировали концентрацию, специфичную для штамма мыши, который мы используем C3 H. Мы обнаружили, что переваривается лучше при 0,8 мг на мил раствор коллагеназы, и мы будем использовать его для инъекции в общий желчный проток для расширения поджелудочной железы. Дрессированный. Сегодняшняя процедура будет проходить в Pavo codre диабетического центра. Он сделает инъекцию, вскроет мышь, обнажит кишечник, а затем сделает инъекцию в общий желчный проток.

Мы опрыскаем мышь этанолом, чтобы волосы были распущены, а затем также проверим, что мышь была принесена в жертву должным образом, ущипнув палец на ноге. Теперь Паво вскроет мышь и обнажит кишечник и поджелудочную железу с помощью разреза по средней линии. Диафрагма также будет разрезана, чтобы убедиться, что мышь будет принесена в жертву.

Прежде чем мы начнем, я хотел бы отметить некоторые важные структуры. Желудок лежит прямо здесь, а поджелудочная железа прикреплена снизу к двенадцатиперстной кишке и выше. Это печень, где мы найдем желчный пузырь и общий желчный проток, который вы можете увидеть прямо здесь.

Итак, что Паво сделает дальше, он изолирует тонкую кишку, найдет, где общий желчный проток входит в тонкую кишку. Как только кишечник обнажен, мы зажимаем по обе стороны от общего желчного протока комарными зажимами. Мы обнаружили, что это позволяет большему количеству коллагенатов проникать в поджелудочную железу, в то время как другие группы пытаются направить зажим на верхнюю часть общего желчного протока.

Мы обнаружили, что это лучший метод, позволяющий ферменту проникать в поджелудочную железу. Это щадящая процедура. Вы же не хотите разрывать кишечник.

Вы должны позволить зажимам аккуратно располагаться по обе стороны от общего желчного протока. Теперь мы найдем желчный пузырь, и как только желчный пузырь обнаружится, мы будем использовать его в качестве руководства для введения коллагеназы в общий желчный проток. Пауэлл использует иглу 30 калибра со шприцем объемом пять куб. см, содержащим три милли раствора коллагеназы.

Когда он входит в общий желчный проток, он расширяет этот проток раствором коллагеназы, а затем движется вниз по общему желчному протоку, пока не доходит до кишечника. И по мере того, как он опускается, ферментные растворы закачиваются в поджелудочную железу. Теперь, когда поджелудочная железа надута раствором коллагеназы, Пауэлл собирается удалить гемостатики, а затем удалить поджелудочную железу у мыши, осторожно оторвав ее от кишечника.

Он выводит его из желудка. Хорошо, а затем, используя селезенку в качестве ручки, он поднимает поджелудочную железу вверх, а затем медленно отрезает ее в общем желчном протоке, и все. Поджелудочная железа выкладывается, затем селезенка удаляется, и там удаляется мезокишечная ткань, а затем поджелудочная железа помещается в двухмиллиметровый раствор коллагеназы и стерилизованный стеклянный флакон и снова помещается на лед.

Изолированная поджелудочная железа, которую мы поместили в стеклянные флаконы, теперь будет помещена в водяную баню при температуре 37 градусов примерно на 17 минут. Мы поместили их в коническую стойку объемом 50 мил, чтобы они не всплывали. Однажды во время ванны запускается таймер и начинается пищеварение.

Как только время переваривания завершено, флаконы вынимают, а затем их осторожно встряхивают и разрушают. И как только ткань начинает разваливаться, флакон кладут на лед. Стерильное сито помещается над стаканом длиной 400 мил, который содержит буфер для стирки.

Затем перевариваемый материал поджелудочной железы осторожно выливается через сито в буфер для промывки. В демонстрационных целях капот был выключен, а стекло капота поднято, чтобы мы могли видеть, что мы делаем. После того, как перевар поджелудочной железы вылит в стакан, флаконы ополаскивают тем же промывочным буфером, а промывочный буфер помещают над ситом.

У нас есть шприц, наполненный промывочным буфером. Мы будем использовать его для принудительного промывания салфетки через экран. Идея состоит в том, чтобы освободить любые свободные люверсы, которые не прикреплены к матрице, но оставляют мембраны и непереваренную ткань на экране.

И когда вы закончите стирку салфетки, это то, что вы обычно видите в конце процедуры. Ткань поджелудочной железы, которая находится на дне пробирки, теперь будет перенесена на две 50 мил конусообразной, и ткань будет промыта, ткань равномерно перемешана, а затем равномерно распределена так, чтобы у нас был равный объем гранул в каждой пробирке. Теперь стакан промыт с большим количеством буфера для стирки.

Боковые стороны промываем так, чтобы все ткани, которые попали в стакан, снова попадают. Затем он равномерно распределяется между каждыми двумя, оба по 50 мил. Затем конические элементы заполняются промывочным буфером.

Ткань переворачивают несколько раз, а затем помещают в центрифугу. Это быстрый спин. Центрифуге дают набрать тысячу оборотов в минуту, а затем выключают.

Ткань в это время очень чувствительна к S-образным люверсам, и вы не хотите чрезмерно их уплотнять. Трубочки вынуты, и мы проделаем этот этап промывки еще три раза. На этом третья промывка подошла к концу.

Компоненты конической трубки диаметром 50 мил передаются в коническую трубу 15 и центрифугу на тысячу RP M, а затем останавливаются. Супернат будет удален, и начнется первая часть FI Call. Мы находимся на этапе, когда наши гранулированные поджелудочные железы перевариваются.

Мы ресуспендируем эту ткань, чтобы она была красивой и рыхлой для гранул. Мы добавим первый градиент плотности, который равен 1 1 0 8. Мы добавим по пять милов в каждую трубку.

Затем гранулы тщательно перемешиваются в каждом из градиентов. Важно, чтобы вы получили хорошее распределение тканей в самом сильном градиенте. Теперь мы наложим два мила плотности 1 0 9 6.

Затем мы наложим два мила плотности 1 0 6 9, а затем поверх этого 1 0 3 7 плотности. Это важно, когда вы наслаиваете плотности, которые не смешиваете. Затем все слои были добавлены в трубку.

И вы можете видеть, что это вершина 1 1 0 8, вершина 9 1 0 9 6, вершина 1 0 6 9 и вершина 1 0 3 7. И вы могли видеть, что ткань уже начинает двигаться к своей надлежащей плотности даже без сращения центров. Градиенты фиала доводятся до скорости при 1800 об/мин в течение 15 минут, и не забывайте держать тормоз выключенным после извлечения трубок из центрифуги.

Вы можете видеть между слоями 0 0 9 6 и 0 0 7 есть красивая полоса ткани глаз Пабло. Теперь удалите слой 0, 3, 7, чтобы удалить любые остатки тканей и ДНК, которые могли быть высвобождены во время обработки. Используя стерильную пластиковую пастбищную пипетку, он теперь удалит островковый слой и перенесет его в коническую трубу диаметром 50 мил, содержащую 25 мил буфера для промывки.

Вы должны сделать этот шаг быстро, потому что фол токсичен для люверсов. Мы фактически удалили весь слой 0 6 9 и 0 9 6. Pavo срезает верхнюю часть пластиковой пастбищной пипетки и промывает ее промывочным буфером.

Затем люверсы центрифугируются так же, как мы центрифугировали ранее. Центрифуга доводится до тысячи оборотов в минуту, затем мы останавливаем ее и аспирируем. Надосадочные люверсы будут трижды промыты промывкой.

Итак, мы только что завершили процесс изоляции век, мы перешли от дижеста к градиенту и очищенным пробиркам после третьего промывки с помощью промывочного буфера, мы ресуспендировали проушины в наших средах RPMI и воспроизвели его в планшете для культуры тканей. Эти люверсы теперь готовы к анализу in vitro или подготовке in vivo, такой как трансплантация глазков.