Выделение и культуре клеток из нефрогенной зона эмбриональных почек мышь
22 апреля 2011 г.
В этом докладе мы описываем метод изоляции и культуры нишу клеток-предшественников из эмбриональных почек мыши, которые могут быть использованы для изучения сигнальных путей, регулирующих стволовых / прогениторных клеток из развивающихся почек. Эти культурные клетки очень доступным для небольшой молекулы и рекомбинантного белка лечения и, что важно также, чтобы вирусная трансдукция, которая позволяет эффективно манипуляции кандидатом путей.
Общая цель данной процедуры заключается в получении первичной культуры клеток нефрогенной зоны из развивающейся почки. Для этого сначала из эмбрионов на стадии 17,5 суток выделяют почки. Следующим этапом процедуры является удаление капсул почек.
Затем проводится ограниченный ферментативный переваривание органов для отделения клеток мезенхимы колпачка и стромальных клеток коркового слоя из нефрогенной зоны. Заключительным этапом процедуры является высев клеток на фибронектин и их культивирование в безсывороточной среде. В итоге можно получить результаты, подтверждающие выделение очищенной популяции клеток нефрогенной зоны с помощью иммуногистохимического окрашивания на специфические маркеры.
Хотя этот метод можно использовать для изучения клеточной сигнализации, он также применим для понимания требований к субстрату для экспансии клеток. Например, процедуру методов приживления продемонстрируют Дерек Адамс, техник моей лаборатории, и Аарон Браун, постдок моей лаборатории. После приготовления необходимых растворов и обработки чашек для культивирования тканей согласно письменному протоколу, приступите к препарированию эмбриональной почки мыши, пожертвовав самкой на стадии E 17.5.
В соответствии с правилами вашего учреждения, извлеките матку и поместите ее в чашку Петри, содержащую несколько миллилитров физиологического раствора или DPBS с кальцием и магнием.
Постарайтесь оставить как можно больше остатков крови и тканей вокруг каждого эмбриона, затем с помощью пинцета сделайте круговой разрез брюшной стенки на уровне пупочных связок. После этого положите эмбрион на спину и зафиксируйте плечи одним пинцетом. Вторым пинцетом удалите внутренние органы, начиная от легких и заканчивая мочевым пузырем.
Почки будут прикреплены к задней части комплекса внутренних органов. Затем аккуратно отделите почки от остальных органов. Будьте осторожны, чтобы почки оставались соединенными друг с другом.
Затем зажмите ткань между почками одним пинцетом, а надпочечник, прикрепленный к капсуле одной из почек, захватите другим пинцетом. Осторожно отделите капсулу от почки. Будьте внимательны, чтобы не повредить почку.
Обязательно удалите остатки капсулы с почки, а также матку, если она все еще прикреплена. Повторите процедуру с другой почкой. В завершение обрежьте переносящую пипетку до подходящего диаметра и осторожно перенесите почки в пятимиллилитровую полистирольную пробирку с HBSS.
Повторите процедуру выделения почек для каждого эмбриона и объедините их в пробирке в стерильных условиях (до восьми почек в одну пробирку). Начните процесс ферментативного переваривания, сначала удалив с помощью пипетки раствор HBSS из пятимиллилитровой пробирки с почками. Будьте осторожны, чтобы не касаться почек, и немедленно добавьте 1,5 мл коллагеназы, раствора для переваривания панкреатином.
Повторите процедуру для каждой пробирки с почками и закройте пробирки крышками. Затем поместите их в смеситель в инкубаторе при 37 °C на 15 минут. Непосредственно перед окончанием инкубации добавьте 3 µL DNAs с концентрацией 1 unit/µL в новую полистирольную пробирку объемом 5 мл для каждого выполняемого расщепления.
После инкубации быстро извлеките digested образец из инкубатора, добавьте 75 µL FBS и переверните пробирку три раза для перемешивания. Оставьте образец при комнатной температуре на две минуты. Затем перенесите 1,4 мл клеточной суспензии в полистирольную пробирку объемом пять мл, содержащую DNAs Mix, и поместите в ротор инкубатора при 37 °C на 10 минут.
После инкубации перенесите каждую суспензию клеток в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 325 ×g в течение пяти минут. Затем удалите супернатант. Центрифугируйте пробирки при 325 ×g в течение пяти минут. Ресуспендируйте осадок в 1 мл 5% FBS в PBS, прокачивая жидкость через пипетку вверх-вниз пять-шесть раз.
Закрывайте каждую пробирку крышкой перед переходом к следующему образцу. После центрифугирования извлеките SNAT и добавьте по 500 µL KSFM с добавками в каждую пробирку, когда среда будет добавлена во все пробирки. Осторожно ресуспендируйте каждый осадок клеток, 5–6 раз перемешивая содержимое с помощью микропипетки объемом 1 mL. Объедините все клеточные суспензии в новой полистирольной пробирке объемом 5 mL.
Теперь профильтруйте клеточную суспензию через предварительно смоченную колбочку с клеточным фильтром с размером пор 40 микрон и соберите фильтрат в новую полистирольную пробирку. Избегайте касания фильтра кончиком пипетки после сбора всего фильтрата. Повторно профильтруйте полученный фильтрат через новую предварительно смоченную колбочку с клеточным фильтром.
Снимите сито и закройте пробирку стерильной крышкой от новой пробирки. Подсчитайте количество клеток и высейте их с плотностью от 100 000 до 200 000 клеток на квадратный сантиметр в среду KSM с добавками в планшет для культивирования с волоконным кодированием. Поместите клетки нефрогенной зоны в увлажненный инкубатор при 37 °C и 5% carbon dioxide на два-четыре часа для восстановления и адгезии перед началом любой стимуляции в рамках эксперимента.
Представлено фазово-контрастное изображение (20x) клеток нефрогенной зоны, высеянных с плотностью 200 000 cells per square centimeter и культивируемых в течение 24 часов. На данном изображении клетки нефрогенной зоны окрашены антителами к PAX2, специфичными для клеток-предшественников нефрона (показаны красным цветом), а ядра окрашены контрастным красителем DAPI (показаны синим цветом).
На изображении в фазовом контрасте при 40-кратном увеличении показан кластер предшественников нефронов. Для дальнейшего подтверждения специфичности клетки нефрогенной зоны были выделены из эмбрионов, экспрессирующих laxy под контролем промотора Fox D one, который активен в популяции стромальных клеток. Затем клетки нефрогенной зоны развивающейся почки были окрашены DAPI (ядра — синим), phalloidin (F-актин — зеленым) и анти-бета-лактазе (красным).
После освоения метода монослойная первичная культура клеток нефрогенной зоны может быть получена примерно за два часа. Такие культуры позволяют проводить быстрые и высокопроизводительные исследования путей клеточной сигнализации при развитии предшественников нефрона, так как они весьма восприимчивы к вирусной трансдукции, воздействию рекомбинантных белков и малых молекул. Для выделения специфических типов клеток из этих культур также могут быть использованы процедуры сортинга клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном отчете описан метод выделения и культивирования клеток-предшественников из эмбриональной почки мыши. Культивируемые клетки подходят для изучения сигнальных путей, регулирующих стволовые клетки и клетки-предшественники в процессе развития почек.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нефрология
- Клеточная биология
- Биология развития
Теоретические основы
- Нефрогенная зона имеет решающее значение для развития почек.
- Понимание сигнальных путей клеток-предшественников может дать полезные сведения для регенеративной медицины.
- Первичные культуры позволяют детально манипулировать клеточными путями.
- Вирусная трансдукция расширяет возможности анализа сигнальных путей.
Цель исследования
- Для получения первичной культуры клеток нефрогенной зоны.
- Для изучения сигнальных путей, регулирующих развитие почек.
- Для обеспечения возможности воздействия малыми молекулами и белками.
Используемые методы
- Диссекция почек эмбрионов на сроке 17,5 суток.
- Удаление капсул почек.
- Ферментативное расщепление для выделения специфических типов клеток.
- Посев клеток на фибронектин и культивирование в безсывороточной среде.
Основные результаты
- Успешное выделение очищенной популяции клеток нефрогенной зоны.
- Иммуноокрашивание подтвердило идентичность культивируемых клеток.
- Клетки пригодны для вирусной трансдукции с целью манипуляции сигнальными путями.
- Результаты обосновывают проведение дальнейших исследований сигнализации при развитии почек.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный подход к изучению клеток-предшественников почек.
- Он открывает возможности для исследования терапевтических мишеней при заболеваниях почек.
- В будущих исследованиях эта модель может быть использована для регенеративных целей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Изоляция и культивирование клеток нефрогенной зоны эмбриональной почки мыши позволяют напрямую исследовать сигнальные пути стволовых клеток и клеток-предшественников в контролируемой и доступной системе. Данный подход решает проблему изучения механизмов обновления в противовес механизмам дифференцировки вне ограничений культуры целого органа, что обеспечивает прогностическую уверенность при ранней валидации мишеней и снижении рисков при изучении сигнальных путей. Этот метод стратегически ориентирован на исследовательские группы, стремящиеся развивать программы регенеративной медицины и моделирования заболеваний с использованием надежных количественных показателей клеточного отклика.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках в области биофармацевтики
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить механистический анализ сигнальных путей, регулирующих самообновление и дифференцировку предшественников нефронов.
- Обеспечивает функциональную валидацию регуляторов-кандидатов, выявленных в ходе генетического или транскриптомного скрининга.
- Способствует снижению биологических рисков за счет изоляции эффектов конкретных белков, малых молекул или нокдауна генов.
- Предоставляет платформу для повышения прогностической достоверности при выборе мишеней для разработки препаратов для лечения заболеваний почек и методов регенеративной медицины.
Скрининг и разработка анализа
- Создает воспроизводимую, валидированную по маркерам систему первичных клеток для разработки количественных анализов.
- Обеспечивает стандартизированную оценку влияния соединений на пролиферацию, гибель клеток и экспрессию маркеров.
- Подготавливает базу для высокопроизводительного скрининга за счет возможности вирусной трансдукции и обработки рекомбинантными белками.
- Позволяет масштабировать подготовку популяций клеток, релевантных конкретному заболеванию, для последующих этапов исследования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты исследований in vitro с биологией нефрогенной зоны in vivo для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от механистических исследований на этапе открытия до валидации на доклинических моделях.
- Позволяет с учетом рисков продвигать гипотезы о регенеративной и болезнь-модифицирующей терапии.
- Поддерживает снижение механистических рисков для портфелей исследований в области клеточной терапии и заболеваний почек.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод первичного культивирования клеток служит связующим звеном между этапом ранних открытий и доклиническими исследованиями, позволяя осуществлять прямое манипулирование и количественный анализ процессов принятия решений о судьбе клеток-предшественников нефрона.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о регуляции стволовых клеток/клеток-предшественников и картировании сигнальных путей.
- Скрининг: предоставляет валидированную, воспроизводимую систему для проведения анализов с использованием соединений и генетических пертурбаций.
- Аналитика: предоставляет количественные данные о пролиферации, гибели клеток и экспрессии маркеров для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: способствует приведению результатов in vitro в соответствие с процессами развития in vivo и стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное использование: предлагает многократно используемую, адаптируемую платформу для различных программ по исследованию почек и разработке терапевтических методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность в валидации мишеней и снижает неопределенность механизмов в исследованиях развития почек.
- Операционная ценность: стандартизирует выделение и культивирование первичных клеток для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости между исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно использовать капитал для продвижения проектов в области почечной и регенеративной медицины.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и передачу знаний между программами в рамках разработки методов лечения заболеваний почек и в регенеративной медицине.
Особенности внедрения
- Требуется опыт в области эмбриональной диссекции, ферментативного расщепления и методов первичного культивирования клеток.
- Необходим доступ к инфраструктуре для культивирования тканей, инструментам анализа маркеров и возможностям вирусной трансдукции.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов изоляции клеток, плотности посева и валидации маркеров.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации условий расщепления и культивирования.
- Ограничения включают необходимость точного соблюдения времени и правил обращения для сохранения жизнеспособности и фенотипа клеток-предшественников.
