Измененный ES / OP9 сотрудничеству культуры протокола обеспечивает повышенную характеристика гемопоэтических Потомство

Общая цель следующего эксперимента заключается в дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мыши в различные примитивные и окончательные гемопоэтические линии. Для характеристики всех потомков ЭСК дифференцировка гемопоэтических клеток мыши достигается путем высева ЭСК на конфлюэнтный слой стромальных клеток OP9, меченных флуоресцентным белком M strawberry. Каждый день дифференцировки или совместного культивирования представляет различные стадии гемопоэтического развития в соответствующий момент сбора материала.

Дифференцированные потомки ЭСК могут быть отделены от стромальной клеточной линии M strawberry OP nine методом сортинга клеток. Данный протокол дифференцировки ЭСК воспроизводит примитивный и дефинитивный гемопоэз, наблюдаемый in vivo, и может быть использован для характеристики гемопоэтических дефектов, связанных с нокаутированными линиями ЭСК, без использования эмбрионов. Здравствуйте, добро пожаловать в лабораторию доктора Джудит Гассен в Комплексном онкологическом центре Джонсона при UCLA.

Меня зовут Алисия Поз. Основное преимущество метода, который я продемонстрирую вам сегодня, по сравнению с существующими методами кокультивирования с клетками OP9, заключается в том, что данная процедура позволяет пассировать все клетки 5-го и 8-го дня, а также полностью отделять всё потомство, производное от ЭСК. Стормальные клетки OP9 выращивают в среде для культивирования клеток OP9, которую необходимо менять каждые два дня.

Клетки OP9 следует пересевать за три дня до начала совместного культивирования. Важно отметить, что при поддержании культуры плотность клеток OP9 не должна превышать 90% конфлюэнтности. Сначала промойте клетки дважды раствором PBS, затем добавьте ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ПОДОГРЕТЫЙ 0,1% раствор трипсин-ЭДТА на пять минут. Когда клетки открепятся, ДОБАВЬТЕ питательную среду для культивирования клеток OP9 и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл.

После центрифугирования при 300 G в течение пяти минут при комнатной температуре осадите клетки в пробирке, удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в свежей среде для культивирования клеток M strawberry OP9. В день начала эксперимента по совместному культивированию высейте клетки с минимальной плотностью 10⁴ клеток/см². Клетки OP9, прошедшие субкультивирование три дня назад, должны образовать сплошной монослой. ЭМК должны культивироваться в соответствии со стандартным протоколом для вашей конкретной клеточной линии.

Дважды промойте ЭСК раствором PBS, обработайте их 0,25% раствором трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение пяти минут при 37 °C. Затем добавьте к ЭСК среду для дифференцировки в условиях кокультивирования и перенесите их в конические пробирки объемом 15 мл. Осадите ЭСК центрифугированием при 400 G в течение пяти-семи минут при комнатной температуре.

После удаления супернатанта ресуспендируйте ЭСК в среде для дифференцировки сокультуры. Используйте иглу с тупым концом калибра 21G для получения суспензии одиночных клеток. Подсчитайте количество клеток, используя трипановый синий и гемоцитометр.

Теперь извлеките колбу с M strawberry. Достаньте клетки OP9 из инкубатора. Удалите среду из клеток OP9 и добавьте в планшет-колбу среду для дифференцировки кокультур.

В каждый флакон с клетками M strawberry OP nine добавьте 1 × 10³ клеток ЭСК на квадратный сантиметр; инкубируйте клетки при 37 °C, 5% carbon dioxide во влажной среде. Это нулевой день, и кокультура должна выглядеть следующим образом. Три дня после начала создания кокультуры ЭСК и M strawberry OP nine.

В основном наблюдаются крупные плоские скопления потомков, производных от ЭСК, с четкими границами, а также начинают формироваться некоторые клеточные вихри. Через пять дней после начала совместного культивирования осторожно удалите среду из совместной культуры и замените ее свежей средой для дифференцировки. Правильная дифференцировка ЭСК на сливном слое клеток mStrawberry OP9 должна привести к образованию гемобластов, которые выглядят как наслоенные клеточные скопления.

Наиболее критическим аспектом данной процедуры является обеспечение надлежащей дифференцировки на пятый день совместного культивирования. На этом этапе колонии гематобластов можно увидеть не только микроскопически, но и макроскопически. Осторожно промойте совместную культуру дважды раствором PBS и трипсинизируйте клетки 0,25% трипсином-ЭДТА, смойте клетки с флакона средой для дифференцировки ES и перенесите их в пробирку; осадите клетки центрифугированием при 400 G в течение семи минут при комнатной температуре.

После центрифугирования удалите супернатант и добавьте свежую среду. Затем используйте иглу с тупым концом 21G для ресуспендирования клеток. Чтобы убедиться в получении суспензии из одиночных клеток, подсчитайте их с помощью гемоцитометра; к этому моменту количество ЭСК должно увеличиться в 100–150 раз по сравнению с нулевым днем. На восьмой или девятый день пересейте клетки кокультуры на новый слой конфлюэнтных клеток M strawberry OP9, а на 12-й день проведите повторный подсчет клеток. Удалите среду с гемопоэтическими клетками и сохраните ее.

Промойте монослой один раз раствором PBS. Чтобы удалить гемопоэтические клетки из суспензии и сохранить их, добавьте в колбу 0,25% трипсин-ЭДТА; после прикрепления трипсином смойте клетки с поверхности колбы с помощью среды для дифференцировки ЭС и объедините их с гемопоэтическими клетками из суспензии. Центрифугируйте клетки при 400 G в течение семи минут при комнатной температуре. В завершение ресуспендируйте клетки с помощью тупоконечной иглы 21G и проведите подсчет клеток. Теперь клетки готовы к повторному посеву или использованию в последующих анализах.

Система совместного культивирования ES M strawberry OP nine может быть использована для моделирования описанного гемопоэтического развития. Ниже представлен обзор временного графика совместного культивирования с указанием дней, когда дифференцированные потомки ES необходимо перенести на новые клетки M strawberry OP nine. Надлежащая дифференцировка клеток ES на слитном слое клеток M strawberry OP nine приведет к продукции flick one положительных клеток.

Ангиобласты на пятый день совместного культивирования. Остеобласты являются общими мезодермальными предшественниками эндотелиальных и гемопоэтических линий и должны выглядеть как скопления клеток, как показано на этом изображении. По мере продолжения совместного культивирования на шестой или седьмой день должны появиться кластеры из двух-четырех клеток, которые затем вырастут в более крупные клеточные скопления. К восьмому или девятому дню присутствуют гемопоэтические предшественники (они появляются уже к шестому дню), а терминально дифференцированные гемопоэтические линии появляются к 14-му дню.

Напротив, при неправильной дифференцировке ESL в сокультуре полученное потомство из ЭК к пятому дню не будет формировать структуру, напоминающую земной шар. Отсутствие клеток в виде структуры земного шара указывает на неправильное формирование бластоидов GIO. Сокультуру с нарушенным формированием эбластоидов следует утилизировать в рамках данного модифицированного протокола сокультивирования ЭК с OP9, так как это в конечном итоге приведет к задержке дифференцировки гемопоэтического ряда.

Потомство, производное от ЭСК, является негативным по маркеру m strawberry, что позволяет отсортировать его с помощью проточной цитометрии от позитивных по m strawberry клеток. Для оценки отберите девять клеток в любой день совместного культивирования. Здесь представлены результаты репрезентативного эксперимента.

Ранее опубликованные протоколы совместного культивирования ES OP девяти фокусировались исключительно на пассировании и оценке неадгезивных плавающих клеток. В данном модифицированном протоколе пассируются и могут быть подвергнуты оценке все клетки, производные от ES, как адгезивные, так и неадгезивные. Это приводит к увеличению выхода гемопоэтических клеток, позволяет идентифицировать редкие популяции клеток и обеспечивает полную характеристику всех потомков ES, как гемопоэтических, так и негемопоэтических.