Препарирование Мышь Око за полного горе пигментный эпителий сетчатки

Меня зовут Эллисон Клэйвон. Я работаю в качестве научного сотрудника доктора Алекса Бишопа в Институте исследований детского рака Гри (Gree Children's Cancer Research Institute) при Медицинском центре UT Health в Сан-Антонио, штат Техас. Сегодня я продемонстрирую, как провести диссекцию глаза грызуна для выделения всего слоя ретинального пигментного эпителия.

Эта ткань представляет интерес для изучения развития и заболеваний сетчатки, а также служит местом проведения анализа гомологично-направленной репарации ДНК in vivo. Итак, приступим. Перед нами глаз, готовый к диссекции.

Для начала рассмотрим анатомические структуры, которые будут служить ориентирами на протяжении всей процедуры. Перед нами глаз дикого животного. Здесь, в задней части глаза, виден зрительный нерв.

Это роговица. Через роговицу видна радужная оболочка. Белесая область в задней части глаза — это склера.

Следовательно, эта область называется границей роговицы и склеры. Первым этапом препарирования является удаление посторонних тканей, таких как соединительная ткань мышц и зрительный нерв. Затем необходимо удалить роговицу, выполнив круговой разрез.

На этом этапе линзу можно извлечь, в результате чего получится пустая глазная чаша. Затем делают четыре разреза от границы роговицы и склеры в направлении головки зрительного нерва. Полученная структура напоминает четырехлепестковый цветок.

Затем каждый из четырех лепестков разрезается посередине, в результате чего получается структура, напоминающая цветок с восемью лепестками. На этом этапе материал может деформироваться в некоторых областях из-за своей сферической формы. Чтобы предотвратить это и добиться более плоского крепления отверстия, можно сделать восемь коротких надрезов в местах деформации.

На вашем рабочем месте должны быть под рукой следующие материалы: пипетка на 100 или 200 µL с соответствующими наконечниками, чашка Петри X-P-B-S-A диаметром 35 мм, предметные и покровные стекла, 90% глицерин и прозрачный лак для ногтей для подготовки препаратов, штатив для сушки стекол, упаковка салфеток Kim wipes и контейнер для утилизации отходов. Помимо этих стандартных материалов, вам также понадобится набор специализированных инструментов для микродиссекции, включая прямые пинцеты; пинцеты с углом 45 градусов используются для удержания, поворота и общего манипулирования глазом в процессе диссекции. Пинцеты с углом 15 градусов имеют наклон вверх и также применяются для перемещения и манипуляций с глазом.

Наконец, вам понадобится пара пружинных ножниц. Очень важно использовать именно пружинные ножницы, а не ножницы традиционного типа. Перед началом диссекции убедитесь, что высота вашего стула отрегулирована так, чтобы при прямой осанке ваши глаза находились на одном уровне с окулярами.

Сутулость при работе с микроскопом вызывает боли в плечах и спине, а также снижает качество проведения диссекции. Для начала налейте XPBS в крышку чашки диаметром 35 мм. Затем перенесите глаза, предназначенные для диссекции, в чашку.

Это глаз мыши линии C 57 дикого типа. Видно, что он очень маленький, примерно три с половиной миллиметра в диаметре. Из-за прозрачности склеры он имеет голубоватый оттенок.

Первым этапом диссекции является удаление всех посторонних тканей вокруг глаза, таких как соединительная ткань мышц и зрительный нерв. В данном случае в левой руке я держу пинцет под углом 45 градусов, а в правой — пинцет под углом 15 градусов. Можно использовать один пинцет для фиксации глаза, в то время как другим будет отделяться ткань.

Когда отделяется большой фрагмент ткани, осторожно протрите пинцет салфеткой Kimwipe. Будьте аккуратны, чтобы не раздавить и не проколоть глаз. Одним из преимуществ проведения данной диссекции в подвешенном состоянии является возможность легко видеть соединительную ткань, отделяющуюся от глаза.

В конце концов вы дойдете до момента, когда удаление тканей с помощью пинцета станет невозможным. Замените пинцет с углом 45° на пружинные ножницы. С помощью пружинных ножниц перережьте зрительный нерв.

Используйте внешний край лезвия, чтобы сдвинуть ткань вперед к границе роговицы и склеры. Затем обрежьте ткань и осторожно протрите ножницы салфеткой Kimwipe. Давайте разберем этот момент еще раз.

Если ткань приподнялась, прижмите её вперед к границе роговицы и склеры внешней стороной ножниц. Обрежьте её, продолжая перемещать фрагменты ткани вперед тупым концом ножниц и последовательно удалять их, пока вся лишняя ткань не будет удалена. Как правило, на глазу имеется две полосы плотной ткани.

Первый прикреплен в месте разделения роговицы и склеры, а второй показан в процессе обрезки. Эта точка находится примерно на полпути между разделением роговицы и склеры и головкой зрительного нерва. Следующим этапом диссекции является удаление роговицы и хрусталика.

С помощью пинцета с изгибом 45 градусов захватите и приподнимите лоскут примерно в центре роговицы. Затем с помощью пружинных ножниц сделайте небольшой надрез у основания лоскута. Введите нижнее лезвие ножниц в надрез под радужную оболочку.

Сделайте надрез в направлении лимба (границы роговицы и склеры), но не заходя за него. Теперь медленно поверните глаз на 360 градусов, делая небольшие надрезы по всему периметру. Старайтесь держать ножницы под радужкой, одновременно рассекая и роговицу, и радужку.

Чтобы выполнять эту процедуру так же легко, как я демонстрирую здесь, требуется длительная практика. После удаления роговицы поверните глаз на бок и осторожно нажмите на внешнюю сторону глаза, чтобы вытолкнуть хрусталик. Оставшаяся структура будет напоминать чашу.

Глаз необходимо разделить на четыре части. Для этого положите глаз на бок и введите нижнее лезвие пружинных ножниц. Выполните продольный разрез в направлении головки зрительного нерва, не доходя до нее.

Для этого держите руки по бокам, а ножницы перед собой примерно перпендикулярно телу и линии разреза глаза. Сделайте второй разрез точно напротив первого. Не торопитесь с выравниванием, чтобы разрез получился ровным.

Многократные разрезы могут привести к появлению зазубрин, однако при тщательном совмещении они будут незаметны; обратите внимание, что я работаю с учетом сферической формы глаза, а не вопреки ей, так как глаз сохраняет свою естественную форму. После выдерживания в PBS остальная часть диссекции будет проводиться на предметном стекле. Аккуратно зафиксируйте глаз пинцетом с углом 45 градусов и извлеките его из PBS.

Поместите глаз на новый предметное стекло. С помощью двух пар угловых пинцетов осторожно разверните глаз. Обратите внимание, что по периметру глаза имеется небольшой край роговицы и радужной оболочки, что удобно для манипуляций.

Затем необходимо разрезать каждый из четырех лепестков пополам. Поверните глаз так, чтобы один из лепестков располагался перпендикулярно вашему телу. Захватите край лепестка пинцетом с изгибом 15 градусов.

Слегка приподнимите и сделайте разрез от границы роговицы и склеры в сторону головки зрительного нерва. Эти разрезы должны быть перпендикулярны касательной. Касательная — это линия, перпендикулярная диаметру.

Таким образом, разрезы должны проходить вдоль диаметра глаза. Теперь поверните предметное стекло так, чтобы следующая педаль была перпендикулярна вашему телу, и повторите процедуру. Захватите угол педали.

Слегка приподнимите и сделайте разрез. Повторяйте процедуру до тех пор, пока каждый из четырех крупных лепестков не будет разрезан пополам. Беловатое вещество представляет собой нейросенсорную сетчатку, которая непосредственно перекрывает РПЭ.

Нейросенсорная сетчатка может защитить РПЭ, поэтому оставляйте ее на месте до завершения всех разрезов. Обратите внимание на то, что педали слегка изогнуты. Не пытайтесь этому противодействовать.

Тщательно выровняйте образец, чтобы сделать один качественный разрез. Поскольку глаз имеет округлую форму, он может деформироваться; чтобы предотвратить это, можно сделать восемь вспомогательных надрезов.

По одному на каждом лепестке. Используйте ту же базовую стратегию, что и в предыдущем раунде из четырех разрезов. Приподнимите край лепестка и сделайте разрез, но в данном случае надрежьте лепесток примерно на половину его длины.

После выполнения всех разрезов можно извлечь нейросенсорную сетчатку. Здесь я добавляю несколько капель 1×PBS к образцу. Не допускайте высыхания RPE.

Нейросенсорная сетчатка должна быть лишь слабо связана с подлежащим РПЭ. Заметно, что она отделяется довольно легко. Однако обычно она остается прикрепленной в области перехода роговицы в склеру, которая внутри глаза представляет собой бугристый гребень, называемый цилиарным телом.

Вы можете ввести кончик своих щипцов под углом 15 градусов в головку зрительного нерва, чтобы зафиксировать образец при отделении нейросенсорной сетчатки. Цилиарное тело отмечает край РПЭ — темнопигментированной ткани, которая отслоилась. Здесь видна радужка, а не РПЭ.

Я рекомендую удалить как можно большую часть радужной оболочки, поскольку она очень липкая и может загнуться и прилипнуть к РПЭ, если нейросенсорная сетчатка крошится или если её остатки остаются прилипшими к РПЭ. Вероятно, произошла одна из двух ошибок: либо глаза были зафиксированы неправильно (например, слишком долго или слишком короткий промежуток времени), либо они хранились слишком долго перед диссекцией.

Педаль, которую я здесь открываю, еще не прошла процедуру сокращения. Видно, что педаль находится примерно на одной трети расстояния от края RPE. Именно поэтому рекомендуется использовать восемь сокращений.

После удаления всей нейросенсорной сетчатки несколько раз промойте РПЭ с помощью пипетки 100–200 мкл PBS до полного удаления всех частиц пыли и детрита. Нанесите пипеткой 80–90 мкл 90% глицерина на новый предметное стекло, распределив его в форме прямоугольника. Примечание: это оптимальный объем глицерина для покровного стекла размером 22 × 50 мм; при необходимости отрегулируйте его соответствующим образом.

Для покровных стекол других размеров используйте наконечник пипетки, чтобы распределить глицерин. Будьте осторожны, чтобы не допустить появления пузырьков воздуха в глицерине. Если пузырек все же появился, переместите его к краю, где он лопнет.

Просуньте нижнюю часть пинцета с углом изгиба 15 градусов под РПЭ и осторожно приподнимите его, затем медленно опустите РПЭ в глицерин. РПЭ будет плавать на поверхности глицерина и может немного свернуться или скрутиться. Используйте пинцет, чтобы расправить РПЭ и распределить глицерин по его поверхности.

Если образуются пузырьки воздуха, аккуратно переместите их к краю, где они лопнут, удерживая покровное стекло под углом примерно 45°. Прикоснитесь им к краю глицерина.

Затем переместите его к краю предметного стекла. Придерживая нижнюю часть покровного стекла большим и указательным пальцами, аккуратно поддержите противоположный край пинцетом под углом 15 градусов. Очень медленно опускайте покровное стекло на предметное стекло, как только будет установлен контакт.

Когда покровное стекло достигнет RPE, прекратите опускание, давая глицерину распределиться, затем продолжите медленно опускать стекло. Если опускать покровное стекло слишком быстро, на предметном стекле образуются пузырьки воздуха. Я буду медленно опускать покровное стекло до касания с RPE, позволяя глицерину распределиться.

Видно, что если резко отпустить покровное стекло, образуются пузырьки воздуха. Используйте достаточное количество прозрачного лака для ногтей, чтобы закрепить край покровного стекла по всему периметру предметного стекла.

Это типичный RPE мыши линии C 57 black. Наличие подлежащих сосудов, отмеченных здесь, является нормальным. Также допустимы некоторые вариации пигментации, например, участки, которые кажутся менее пигментированными.

Тем не менее, такие светлые пятна, вероятно, обусловлены физическим повреждением РПЭ и лежащей под ним сосудистой оболочкой. Поскольку сосудистая оболочка глаза также пигментирована, повреждение черного РПЭ может остаться незамеченным, если сосудистая оболочка останется неповрежденной.

Это типичный РПЭ мыши с разбавленным окрасом. Как видно, вы сможете наблюдать сосуды, а также некоторые вариации пигментации, такие как более темные и более светлые участки. Однако обнаружить повреждения на РПЭ мыши с разбавленным окрасом практически невозможно.

Являются ли эти небольшие пятна повреждениями или же это нормальная вариация пигментации? Для решения этого вопроса я предлагаю провести окрашивание и анализ формы. Это позволит понять, не слишком ли грубо вы обращаетесь с ними.

Окрашивание четко очерчивает клеточные мембраны, делая поврежденные участки заметными, однако на самом деле RPE довольно устойчив, и если удерживать глаз за роговицу, вероятность нанесения повреждений невелика. Перед вами целый препарат с множеством проблем, наименьшая из которых, отмеченная здесь, — слишком широкий край роговицы, что может привести к деформации и образованию складок на извилистом материале. Также здесь виден массивный фрагмент посторонней ткани, оставшийся на задней части глаза.

Эта педаль частично загнута, и здесь видно, что RPE частично разорван. Другая проблема заключается в том, что этот глаз имеет вид «ветряка». Здесь я обозначил углы разрезов.

Однако именно так они и должны были выглядеть. Помните, что разрезы должны быть перпендикулярны касательной и проходить по диаметру. Я только что продемонстрировал, как препарировать глаз мыши для получения цельного препарата ретинального пигмента.

При работе с эпителием самое важное — поддерживать правильное положение тела, но при этом стараться оставаться расслабленным. Надеюсь, это видео было вам полезно, и желаю вам успехов в ваших будущих экспериментах.