Органотипической мозжечка культур: проблемы и апоптоза Обнаружение

Общей целью данного эксперимента является изучение влияния быстрого лиганда апоптотического стимула на развивающийся мозжечок дикого типа и мутантных мышей. Это достигается путем препарирования мозга мышей дикого типа и нокаута между 8 и 12 днями после рождения. Второй шаг заключается в том, чтобы разрезать мозг на ломтики толщиной 400 микрометров и изолировать мозжечок от каждого среза.

Третий шаг заключается в культивировании срезов мозжечка в течение пяти дней, чтобы убедиться, что они здоровы, прежде чем индуцировать гибель клеток быстрым лигандом. Заключительным этапом процедуры является анализ влияния быстрого лиганда на различные популяции клеток мозжечка дикого типа и нокаутных мышей на основе иммунофлуоресцентного окрашивания для туннеля апоптотических маркеров в сочетании с маркерами, специфичными для типа клеток, такими как кальбиндин для клеток бикини. Основное преимущество мозжечковых культур заключается в том, что они допускают стиль мозжечковой региональной структуры и как первичные диссоциированные культуры, где нейронные сети и несколько организаций нарушены.

Так что этот материал позволит ответить на некоторые ключевые вопросы в нейронауках, тем более что есть дикий тип и мутантная мышь. Таким образом, можно изучать сравнительное развитие, можно изучать физиологию, а также электрофизиологию и фармакологию. Хотя этот метод может дать представление о функции быстрого лиганда в выживании мозжечка или клеток, он также может быть использован в рамках эффектов быстрого лиганда в коре головного мозга и гиппокампе.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что для получения здорового лизиса мозжечка крайне важно как можно быстрее ввести их в культуру без ущерба для их целостности. Поэтому важно иметь хорошие навыки препарирования и нарезки, прежде чем приступать ко всему процессу. Где это возможно.

Этапы следующей процедуры должны быть выполнены в капюшоне для культуры тканей перед вскрытием. Приготовьте среды для рассечения мозга и подготовки срезов, а также среды для посева срезов в соответствии с письменным протоколом и храните их при температуре четыре градуса Цельсия в день вскрытия. Подготовьте планшеты для культивирования тканей для культивирования срезов мозжечка.

Добавьте по одному миллилитру питательной среды для срезов в каждую лунку шестилуночной тарелки. Затем с помощью стерильных щипцов вставьте вставки с культуральными пластинами в каждый из них. Убедитесь, что под вкладышем не застряли пузырьки воздуха.

Поместите планшет для культивирования в инкубатор для тканевых культур, установленный при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа не менее чем на два часа, чтобы предварительно подготовить среду. Далее пузырите ледяной холод. Среда в спинномозговой жидкости с насыщением карбогеном газом изменяет pH раствора и приводит к изменению цвета с красного на оранжевый.

Налейте немного ледяного пузырькового фильтрующего материала в стерильную чашку Петри и шестилуночную тарелку. Положите их на лед вместе с пластиной вибрато, которое будет использоваться для разрезания мозга. Чашка Петри, содержащая пузырьковую ледяную среду A CSF, будет использоваться для препарирования мозга мышиного детеныша P 8 до P 12 после вскрытия.

С помощью лезвия бритвы сделайте сагиттальный разрез в одной полусфере, чтобы обеспечить ровную поверхность для крепления на вибрационной пластине. Ростральная часть коры также может быть перерезана. Высушите охлажденную вибрамную тарелку бумажным полотенцем.

Затем добавьте немного суперклея на сцену и распределите ее зигзагообразно кончиком суперклеевой трубки. Чтобы сформировать тонкий клеевой слой, с помощью шпателя перенесите мозг в стадию вибрато, где сплющенная сторона соприкасается с суперклеем. Как только мозг прикрепится к вибрационной пластине, добавьте достаточное количество ликворовой среды, чтобы покрыть мозг, и добавьте лед под пластиной, чтобы он оставался холодным.

Разрежьте мозг на ломтики по 400 микрометров. Затем используйте пластиковую пипетку для пасты с надрезом. Расширенный конец переложить срезы на шестилуночную пластину, содержащую ликворную среду, на лед работать под рассекающим микроскопом.

Используйте два инсулиновых шприца с иглами малого диаметра 28 калибра, чтобы отделить мозжечок от остальной части мозга. Если на каком-либо из срезов есть суперклей по краю, удалите клей с среза двумя иглами шприца. С помощью пластиковой пипетки для пасты с разрезанным расширенным концом переложите ломтики на верхнюю часть фильтров.

Добавление от одного до трех ломтиков на вкладыш гарантирует, что ломтики полностью вытянуты и что жидкость не покрывает их. При необходимости аспирируйте излишки среды с помощью инкубированной пипетки, 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 48 часов. Через 48 часов замените половину объема фильтрующего материала свежим, убедившись, что под вкладышем не застряли пузырьки воздуха.

Оставшаяся исходная среда содержит срезы производных трофических факторов, которые важны для выживания клеток. Апоптотическая провокация проводится после пяти дней культивирования. Добавьте быстроагонистическое антитело JO 2 в среду для культивирования клеток в лунках, подлежащих лечению.

Оставьте половину лунок необработанными в качестве контрольных. По прошествии 24 часов отсасывайте среду из-под лунок. Затем зафиксируйте ломтики, нанеся один миллилитр ледяного льда, 4%-ный паральдегид под вкладыш и один миллилитр PFA поверх вкладыша.

Дайте ломтикам закрепиться в PFA, 10 минут комнатной температуры через 10 минут. Отсадите PFA и кратковременно промойте двумя миллилитрами холодного пипетирования PBS. Один миллилитр сверху вкладыша и один миллилитр под вкладышем.

Затем аспирируйте PBS и пипеткой один миллилитр 20% ледяного метанола в PBS под вкладышем и один миллилитр над вкладышем. Инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, затем аспирируйте 20% метанол из лунки и хорошо промойте ломтик и D с помощью PBS. Как и раньше, пипетируйте один миллилитр 0,5% Triton X 100 в PBS поверх вкладыша, а еще один миллилитр под вкладышом.

Инкубируйте не менее 12 часов при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы пробить срезы после проникновения. Аспирируйте 0,5% Triton X 100 в PBS и пипетируйте один миллилитр 20% BSA в PBS поверх среза и один миллилитр под ломтиком. Заблокируйте ломтики минимум на четыре часа при комнатной температуре или на ночь при температуре четыре градуса Цельсия.

Когда блокировка будет завершена, чистыми ножницами аккуратно отрежьте кусок мембранной вставки, прикрепленной к срезу мозжечка. Затем с помощью чистых щипцов переложите кусок мембраны в 24-луночную пластину, содержащую PBS, аспирируйте PBS и добавьте 250 микролитров туннельного реагента в каждую лунку. Следя за тем, чтобы реагент покрывал всю поверхность среза.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа в темноте, когда пройдет час. Аспирируйте туннельный реагент из лунок и замените 500 микролитрами PBS. Защитите пластину от света и выдержите ее при комнатной температуре в течение 10 минут для мытья.

Повторите этот процесс дважды после последней стирки. Аспирируйте PBS и добавьте 250 микролитров раствора 1 к 1000 антитела к кальбиндину в PBS и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия в темноте. На следующий день.

Отсадите первичный раствор антитела и промывьтесь PB S3 раза в течение 10 минут. Затем добавьте 250 микролитров вторичного антитела, разведенного один к 500 в PBS. Накройте пластину алюминиевой фольгой для защиты от света и выдерживайте не менее трех часов при комнатной температуре после инкубации.

Промойте ломтики три раза в течение 10 минут с помощью PBS и с помощью монтажного материала, содержащего матрицу. Установите срезы на стеклянный микроскоп, предметное стекло и накройте крышкой. Визуализируйте срезы с помощью конфокального микроскопа, используя длины волн возбуждения 488 нм и 561 нм для капусты, бендина и туннеля соответственно.

На этом изображении показан здоровый срез мозжечка. После двух дней in vitro слой клеточного тела выглядит полупрозрачным, а слоистая структура мозжечка отчетливо видна под микроскопом. После семи дней in vitro все еще видна слоистая структура здорового среза мозжечка.

Кроме того, темные тельца клеток, вероятно, макрофаги, обычно покрывают срез. Конфокальное изображение, показанное здесь, является репрезентативным для быстро обработанного среза мозжечка. Клетки бикини выглядят зелеными после окрашивания первичным антителом, за которым следует конъюгированное вторичное антитело Alexa 4 88.

Апоптотические клетки, положительные на туннельное окрашивание, отображаются красным, так как используемый туннельный комплект помечен TMR. Красные клетки бикини появляются не в одном ряду, а сгруппированными, образуя аналогичную структуру при попытке выполнить эту процедуру. Важно помнить, что по возможности необходимо работать в капюшоне для культуры тканей и свести к минимуму время, в течение которого церебральная ткань подвергается воздействию возможных загрязнителей, таких как бактерии или грибки.

Используя эту процедуру, к этим срезам можно применить другие методы, включая биохимию и электрофизиологический анализ, чтобы получить дополнительную информацию о содержании белка, а также возбудимости нейронов. Этот метод был первоначально разработан для изучения эффекта быстрой опосредованной гибели клеток в клетках Перкина, несущих мутации, влияющие на быстрый путь. Периальные клетки редко выживают в первичной культуре.

Так что эта процедура была лучшим экспериментальным подходом. Так что я надеюсь, что после просмотра этого видео у вас появится хорошее представление о том, как делать срезы цере-бочонка и как можно изучить апатичные стимулы и их влияние на различные типы клеток мозга.