ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Это исследование было частично финансируется IPSEN Foundation. IMV является американский профессор онкологического общества молекулярной биологии, а также заведует кафедрой Ирвина и Джоан Джейкобс в Образцовый наук о жизни. Эта работа была частично поддержана грантами NIH, Leducq фонда, Фонда Meriaux, Эллисон Медицинский фонд, Ипсен / Biomeasure, Sanofi Aventis, рака простаты фонда и HN и Фрэнсис С. Бергер Foundation. PAS финансируется McKnight дарственного фонда для неврологии и Национального института по злоупотреблению наркотиками (R01 DA019022). Авторы хотели бы поблагодарить Марка Шмитта. Графика была разработана Джейми Т. Симоном. Спонсорство был любезно предоставлен Invitrogen.

1. Органотипической мозжечка культур: <ol><li> Чтобы успешно генерировать органотипической мозжечка культуры используют мышей между P0-P3 или P8-P12. Для нашего эксперимента мы использовали мышей в P8-P12 диапазона, поскольку эта стадия развития является более приемлемым для нашего исследования. </li><li> Подготовка вскрытие и культуральной среде: <ol><li> Рассечение мозга и нарезать подготовке проводятся в странах с низким натрия Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF), содержащего 1 мМ хлорида кальция, 10мм D-глюкозы, 4мм хлорид калия, хлорид магния 5 мМ, 26 мм бикарбоната натрия, 246mM сахарозы и фенол красный раствор (1:1000) , рН 7,3. Для стерилизации решение, процеживают через 0,22 мкм фильтр и хранят при температуре 4 ° C. </li><li> Мозжечка ломтиками культивируют в 75% минимально необходимого среднего Eagle (MEM), 25% тепла инактивированной лошадиной сыворотки, 25 мМ HEPES, 1 мМ глутамина, 5 мг / мл, глюкозу, пенициллин (100 ЕД / мл) и стрептомицин (100 ЕД / мл). Фильтры среды, через 0,22 мкм фильтр и хранят при температуре 4 ° С в течение максимум двух недель. </li></ol></li><li> Рассеките мозга в ледяной средой ACSF ранее пузырилась с карбогена (95% кислорода и 5% углекислого газа) Отметим, что насыщение карбогена изменится рН раствора таким образом это будет переход от красного до оранжевого. Вскрытие должно проводиться в минимальный промежуток времени возможны будьте осторожны, чтобы не повредить структуру мозга. </li><li> Нарежьте мозга в сагиттальной разделы 400 мкм использованием vibratome. <ol><li> Сделать сагиттальной вырезать бритвой в одном полушарии, пытается сократить как можно меньше мозжечка; это обеспечит ровную поверхность для резки. Кора используется только для поддержки, чтобы сделать нарезки проще, но поскольку время является важным вопросом удобнее вырезать ростральной половины коры с лезвия бритвы. </li><li> Используйте цианоакрилат (суперклей), чтобы исправить положение мозга на пластине vibratome металла. Важно, чтобы охладить пластины на льду перед добавлением клея и распространить ее также с помощью иглы трубки для формирования тонкого слоя клея. Если есть превышение суперклей, он будет отключаться от пластины, когда он вступает в контакт с ACSF и образца, будут потеряны. </li><li> Как только мозг подключен к vibratome плиты, добавить достаточно средств массовой информации ACSF для покрытия мозга и положить лед под пластиной, чтобы держать это холод. </li><li> Вырезать 400 мкм ломтиками и передача их с пластиковой пипетки Пастера (вырезать наконечник расширить его и избежать повреждения ломтиками) до 6-и клеточных культур пластины, содержащей ACSF на льду. </li><li> Отдельные мозжечка от остальной части мозга с помощью двух инсулиновые шприцы (шприцы с малым диаметром 28-иглы) при вскрытии микроскопом. Некоторые ломтиками будет суперклей прилагается к краям: это момент, чтобы попытаться удалить его, как это может повлиять на жизнеспособность срез. Важно сделать это аккуратно, не повреждая структуры мозжечка. </li></ol></li><li> Передача мозжечка ломтиками до 6-луночных содержащие 30 мм вставки пластины культуры с 0,4 мкм поры. Добавить 1 мл культуральной среды на лунку, которая была заранее обусловлена ​​инкубации в течение не менее 2 часов при 37 ° С и 5% СО 2 (в культуре клеток инкубатор). Место вставки на верхней части средств массовой информации убедившись, что Есть нет воздушных пузырьков под, а затем поместить мозжечка ломтиками (1-3 в вставке) в верхней части вставки убедившись, что они в полной мере расширены и что ни жидкость покрывает их. Аспирируйте избыток средств массовой информации, если это необходимо. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 меняется медиакультуры каждые 2 или 3 дня. Лучше всего заменить только часть среды (например, ½ объема) сразу, так как использовались среда содержит часть полученных трофических факторов, которые важны для выживания клеток. </li></ol> 2. Лечение Fas и окрашивание мозжечка фрагменты: <ol><li> Для эксперимента апоптоза задача, мы впервые культуры ломтики в течение 5 дней меняется СМИ в день в пробирке 3 (div3). На DIV5 культур относятся с 0,5 мкг / мл антитела Jo2 агонист Fas, добавив его непосредственно к средствам массовой информации для того, чтобы иметь чистую фоне гибели клеток с изменениями средства массовой информации может вызвать некоторые смертности в культурах. Половина скважин оставлены без рассмотрения в качестве контроля. </li><li> После 24 часов удалить СМИ под вставки на всасывание. Чтобы исправить ломтиками, добавить 1 мл ледяной 4% PFA ниже и выше 1 мл вставки. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. </li><li> Через 10 минут удалите PFA и промыть холодной кратко PBS. </li><li> Следующая удалить PBS и добавьте 1 мл под 1 мл и выше вставка 20% ледяной метанола в PBS и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре. </li><li> Вымойте снова PBS и добавьте 1 мл под 1 мл и выше вставить в размере 0,5% Triton-X-100 в PBS для пермеабилизации. Инкубировать минимум 12 часов при температуре 4 ° C. </li><li> После пермеабилизации, блок с 20% BSA в PBS в течение минимум4 часа при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. На данном этапе ломтиками могут храниться в блокировании решения, по крайней мере 3-х дней при температуре 4 ° C. </li><li> Для того, чтобы пятно ломтики аккуратно вырезать кусок мембраны вставить прилагаемый к мозжечковой нарезать и перенести его на 24-луночных содержащие PBS. </li><li> Иммуноокрашивания осуществляется последовательно, сначала с реагентом TUNEL в течение одного часа, а затем с антителами Calbidin ночь. <ol><li> Аспирируйте PBS и добавьте 250 мкл с TUNEL реагента в каждую лунку убедившись, что он покрывает всю поверхность среза. Инкубировать при 37 ° С в течение одного часа в темноте. </li><li> Через час удалить TUNEL смесь и промыть PBS три раза в течение 10 минут. </li><li> После последнего вымыть, удалить PBS и добавьте 250 мкл 1 / 1000 разведение антител кальбиндин в ФБР и инкубировать в течение ночи при 4 ° С в темноте. </li><li> Удалите первичный решение антител и промыть PBS три раза в течение 10 минут. </li><li> Добавьте 250 мкл вторичными антителами разбавленного 1 / 500 в PBS и выдержать в течение не менее трех часов при комнатной температуре в темноте. Комплект TUNEL мы использовали помечена красным ПМР, поэтому наши вторичные антитела для кальбиндин сопряжена с Alexa-488. </li><li> Вымойте три раза в течение 10 минут с PBS и смонтировать ломтиками на предметное стекло микроскопа использованием установки средств массовой информации, которая содержит DAPI. </li><li> Изображение ломтики с использованием конфокальной микроскопии 488 нм и 561 нм длине волны возбуждения для кальбиндин и TUNEL соответственно. </li></ol></li></ol> 3. Представитель Результаты: Основной задачей этого протокола является возможность генерировать здоровую часть мозжечка культур, тем более что наша конечная считывания будет гибель клеток. Здоровой культуры предстает как тот, где слоем клеток тела полупрозрачным и позволяет вам видеть слоеного структуры мозжечка под микроскопом (рис. 1). Через несколько дней в культуре ломтиками начать редеть и не-нервных клеток можно наблюдать миграцию от краев среза. Темные клетки круглой (скорее всего, макрофаги), которые покрывают ломтиками через несколько дней в культуре, в конечном итоге снижение числа через 10-14 дней в пробирке (рис. 2) 5. Окончательным доказательством жизнеспособности ломтиками является пятном на различных клеточных маркеров, таких как кальбиндин для клеток Пуркинье. На рисунке 3 показана представитель конфокальной микроскопии изображение слоя клеток Пуркинье с несколькими TUNEL положительных ядер. Важно учитывать, что даже если некоторые ломтики получил апоптоза стимул, они только подвергаются в течение 24 часов. Это позволило достаточно времени, чтобы наблюдать фрагментацию ДНК в умирающей клетки с окрашиванием TUNEL, но определенный слой клеток Пуркинье по-прежнему присутствует. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="Рисунок 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 1"> Рисунок 1. Здоровый мозжечка срез div2. Это изображение показывает полупрозрачный слой клеток организма и слоеного мозжечка структуры в здоровую часть. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="Рисунок 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 2"> Рисунок 2. Здоровый мозжечка срез DIV 7. На этом снимке мы все еще ​​можем наблюдать слоеного структуры мозжечка и появление темных тел клетки. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="Рисунок 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 3"> Рисунок 3. Представитель образ Fas обработанных мозжечка срез. Конфокальной Это изображение показывает Пуркинье клеток, окрашенных кальбиндин (зеленый) и апоптоза клеток положительным для окрашивания TUNEL (красный). Клетки Пуркинье, не отображаются в одной строке, но сгруппированы формирования лепестка-подобные структуры.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

Все животные работ, проводимых было сделано в соответствии с политикой, установленной IACUC. Солка Институт AAALAC аккредитованных объекта.

Этот метод описывает один из многих возможных применений нейронных органотипической культур, и это позволило нам изучить влияние апоптоза стимулов в дикого типа и мутантных мозжечка ломтиками. Наиболее важной частью этого опыта, чтобы иметь возможность последовательно генерировать здоровую мозжечка культур срез. Ключевыми факторами являются рассечение и нарезая технику и способность выполнять протокол хотя бы раз можно, но в то же время будьте осторожны, чтобы не повредить кусочки. Другим важным фактором является подготовка и состав питательной среды, эти культуры очень чувствительны, поэтому нам пришлось испытать несколько рецептов и марки носителей. Даже различных партий сыворотки или любые другие компоненты средств массовой информации могут повлиять на жизнеспособность ломтиками. Мы получили лучшие результаты с лошадиной сыворотки от Invitrogen Лот № 480116. После мозжечка ломтиками генерируются можно изучать мозжечка развития, электрофизиологии, выживаемость клеток в одиночку или в ответ на раздражители апоптоза, эксайтотоксичность или кислородное голодание. Сравнительные исследования с использованием дикого типа и мутантных мозжечка ломтиками был очень проницательным во многих аспектах функции мозжечка и развития.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Сыворотка лошади</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Глутамин</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Пенициллин/стрептомицин</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Суперклей</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Планшеты для культивирования клеток на 6 и 24 лунки</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>Вставки для культуральных планшетов 30 мм (поры 0.4-&amp;mu;m)</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Очищенные антитела к мышиному CD95 (Jo2), полученные от хомяка NA/LE</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>Набор для детекции гибели клеток &lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt;, TMR red</td><td>Roche Group</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>Кроличьи антитела к кальбиндину D-28k</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>Вторичные антитела козьи анти-кроличьи IgG Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Среда для заключения препаратов Vectashield с DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Диссекционный микроскоп</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Вибратом</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Конфокальный микроскоп</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Органотипической мозжечка культур: проблемы и апоптоза Обнаружение

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Органотипической культурах нейронов ткани были впервые введены в 1947 году Hogue 1,2 и составили значительный прорыв в области нейронауки. С тех пор техника получила дальнейшее развитие и в настоящее время Есть много различных способов подготовить органотипической культур. Метод, представленный здесь было приспособлено от того, описывается Stoppini и соавт. Для подготовки ломтиками и от Gogolla и соавт. Для окрашивания процедура 3,4. Уникальная особенность этого метода является то, что он позволяет изучать различные части мозга, таких как гиппокамп и мозжечок в их первоначальную структуру, обеспечивая большое преимущество перед диссоциированных культурах, в котором все клеточной организации и нейронных сетей нарушена. В случае мозжечка это даже более выгодно, поскольку позволяет изучать клеток Пуркинье, чрезвычайно трудно получить как диссоциированных первичной культуре. Этот метод может быть использован для изучения некоторых особенностей развития мозжечка в пробирке, а также для электрофизиологических и фармакологических экспериментов в обоих дикого типа и мутантных мышей. Описанный здесь метод был разработан для изучения влияния апоптоза стимулы, такие как Fas лиганда в развивающихся мозжечка, используя TUNEL окрашивания для измерения апоптоз клеток. Если TUNEL окрашивания в сочетании с типом клеток специфических маркеров, таких как кальбиндин для клеток Пуркинье, можно оценить гибель клеток в популяции клеток, определенным образом. Окрашивание кальбиндин также служит для оценки качества мозжечка культур.

Этот метод описывает генерацию органотипической мозжечка культур и действие определенных апоптоза стимулов на жизнеспособность различных типов клеток мозжечка.

Органотипические культуры нейронной ткани были впервые представлены Хогом в 1947 году 1,2 и стали серьезным прорывом в области нейронаук. ...

Общая цель данного эксперимента заключается в исследовании влияния апоптотического стимула fast ligand на развивающийся мозжечок мышей дикого типа и мутантных мышей. Для этого сначала проводят препарирование мозга мышей дикого типа и нокаутных мышей в период между 8-м и 12-м днями после рождения. На втором этапе мозг нарезают на срезы толщиной 400 µm и из каждого среза изолируют мозжечок.Третьим этапом является культивирование срезов мозжечка в течение пяти дней, чтобы убедиться в их жизнеспособности перед индукцией гибели клеток с помощью fast ligand. Заключительным этапом процедуры является анализ эффекта fast ligand в различных популяциях клеток мозжечка мышей дикого типа и нокаутных мышей на основе иммунофлуоресцентного окрашивания на маркер апоптоза tunnel в сочетании с маркерами специфичными для типов клеток, такими как кальбиндин для клеток Пуркинье. Основным преимуществом живых культур мозжечка является то, что они позволяют сохранить региональную структуру мозжечка, в отличие от первичных диссоциированных культур, в которых нейронные сети и структурная организация нарушены.Таким образом, данный подход позволит ответить на некоторые ключевые вопросы нейронаук, в особенности благодаря наличию мышей дикого типа и мутантных мышей. Это дает возможность изучать сравнительное развитие, физиологию, а также электрофизиологию и фармакологию. Хотя этот метод может дать представление о функции fast ligand в выживании клеток мозжечка, он также может быть использован для изучения эффектов fast ligand в коре головного мозга и гиппокампе.Как правило, люди, впервые использующие этот метод, сталкиваются с трудностями, так как для получения жизнеспособного лизата мозжечка критически важно поместить клетки в культуру как можно быстрее, не нарушая их целостности. Поэтому, прежде чем приступать к полноценному процессу, важно овладеть навыками препарирования и нарезки тканей. По возможности.Этапы следующей процедуры следует выполнять в ламинарном шкафу для культивирования тканей перед проведением диссекции. Приготовьте среду A CSF для диссекции мозга и подготовки срезов, а также среду для культивирования срезов в соответствии с письменным протоколом и храните их при температуре 4 °C в день диссекции. Подготовьте планшеты для культивирования тканей для выращивания срезов мозжечка.Добавьте по 1 mL среды для культивирования срезов в каждую лунку планшета на шесть лунок. Затем с помощью стерильного пинцета поместите в каждую лунку вкладыши для культур. Убедитесь, что под вкладышем не осталось пузырьков воздуха.Поместите чашку с культурой в инкубатор для культур тканей, настроенный на 37 °C и 5% carbon dioxide, минимум на два часа для предварительной подготовки среды. Затем продуйте ледяную среду CSF карбогеном; насыщение среды карбогеном изменяет pH раствора, что приводит к изменению цвета с красного на оранжевый.Налейте небольшое количество охлажденного до 0 °C насыщенного кислородом раствора A CSF в стерильную чашку Петри и в 6-луночный планшет. Поместите их на лед вместе с планшетом вибратома, который будет использоваться для срезания мозга. Чашка Петри с охлажденным до 0 °C насыщенным кислородом раствором A CSF будет использоваться для выделения мозга из детеныша мыши в возрасте от P8 до P12 после препарирования.С помощью лезвия бритвы сделайте сагиттальный разрез в одном полушарии, чтобы создать плоскую поверхность для закрепления на виброплатформе. Ростральную часть коры также можно иссечь. Протрите охлажденную виброплатформу бумажным полотенцем досуха.Затем нанесите немного суперклея на предметный столик и распределите его зигзагообразными движениями с помощью носика тюбика. Чтобы сформировать тонкий адгезивный слой, используйте шпатель для переноса мозга на столик вибратома так, чтобы плоская сторона соприкасалась с суперклеем. После закрепления мозга на платформе вибратома добавьте достаточное количество среды A CSF, чтобы полностью покрыть образец, и поместите под платформу лед для поддержания низкой температуры.Разрежьте мозг на срезы толщиной 400 µm. Затем, используя пластическую пастеровскую пипетку с расширенным концом, перенесите срезы в 6-луночный планшет с искусственной спинномозговой жидкостью (A CSF), находящийся на льду, работая под диссекционным микроскопом.Используйте два инсулиновых шприца с тонкими иглами калибра 28 G, чтобы отделить мозжечок от остальной части мозга. Если на краях каких-либо срезов имеется суперклей, удалите его с помощью игл двух шприцев. Используйте пластиковую пастеровскую пипетку с обрезанным и расширенным концом, чтобы перенести срезы на верхнюю часть фильтров.Поместите от одного до трех срезов на один вкладыш, убедившись, что срезы полностью расправлены и не покрыты жидкостью. При необходимости удалите избыток среды с помощью пипетки. Инкубируйте при 37 °C и 5% carbon dioxide в течение 48 часов. По истечении 48 часов замените половину объема среды на свежую, следя за тем, чтобы под вкладышем не образовались пузырьки воздуха.Оставшаяся исходная среда содержит секретируемые производные трофические факторы, которые важны для выживания клеток. Индукция апоптоза проводится после пяти дней культивирования. Добавьте быстродействующее агонистическое антитело JO 2 в среду для культивирования клеток в лунках, предназначенных для обработки.Половину лунок оставьте необработанными в качестве контроля. По истечении 24 часов аспирируйте среду из-под лунок. Затем зафиксируйте срезы, пипетируя один миллилитр ледяного 4% паральдегида под вкладыш и один миллилитр PFA поверх вкладыша.Оставьте срезы фиксироваться в PFA при комнатной температуре в течение 10 минут. Отсосите PFA и коротко промойте, пипетируя два миллилитра холодного PBS: один миллилитр сверху вставки и один миллилитр под вставкой.Затем аспирируйте PBS и пипеткой внесите 1 мл 20% ледяного метанола в PBS под вкладыш и 1 мл над вкладышем. Инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, затем аспирируйте 20% метанол из лунки и промойте срез и лунку D раствором PBS. Как и прежде, внесите пипеткой 1 мл 0,5% Triton X 100 в PBS на поверхность вкладыша и еще 1 мл под вкладыш.Инкубируйте срезы в течение минимум 12 часов при температуре 4 °C для обеспечения пермеабилизации после проведения процедуры. Отсосите 0,5% Triton X 100 в PBS, затем нанесите с помощью пипетки 1 мл 20% BSA в PBS на поверхность среза и 1 мл под срез. Проводите блокировку срезов в течение минимум четырех часов при комнатной температуре или в течение ночи при температуре 4 °C.После завершения блокировки осторожно вырежьте чистыми ножницами фрагмент мембранного вкладыша, прикрепленный к срезу мозжечка. Затем с помощью чистых пинцетов перенесите фрагмент мембраны в 24-луночный планшет с PBS, аспирируйте PBS и добавьте по 250 µL реагента для TUNEL в каждую лунку. Убедитесь, что реагент полностью покрывает поверхность среза.Инкубируйте при 37 °C в течение одного часа в темноте. По истечении часа аспирируйте реагент для окрашивания туннелей из лунок и замените его 500 µL PBS. Защитите планшет от света и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут для промывки.Повторите эту процедуру дважды после последнего промывания. Отсосите PBS и добавьте 250 µL антител к кальбиндину в разведении 1:1000 в PBS, затем инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C в темноте. На следующий день.Отоберите раствор первичных антител и трижды промойте планшет PBS в течение 10 минут. Затем добавьте 250 µL вторичных антител, разведенных в PBS в соотношении 1:500. Накройте планшет алюминиевой фольгой для защиты от света и инкубируйте при комнатной температуре не менее трех часов после инкубации.Промойте срезы трижды по 10 минут в PBS и используйте среду для заключения, содержащую DAPI. Закрепите срезы на предметном стекле микроскопа и накройте покровным стеклом. Снимите изображения срезов с помощью конфокального микроскопа, используя длины волн возбуждения 488 нанометров и 561 нанометров для визуализации Iba1, GFAP и TUNEL соответственно.На этом изображении показан здоровый срез мозжечка. Через два дня культивирования in vitro слой тел клеток выглядит полупрозрачным, а листоватая структура мозжечка отчетливо видна под микроскопом. Через семь дней культивирования in vitro листоватая структура здорового среза мозжечка по-прежнему сохраняется.Кроме того, срез обычно покрыт темными телами клеток, вероятно, макрофагами. Представленное здесь конфокальное изображение является типичным для среза мозжечка, обработанного fast. Клетки Бикини выглядят зелеными после окрашивания первичным антителом, а затем вторичным антителом, конъюгированным с Alexa 4 88.Апоптотические клетки, положительные по результатам окрашивания TUNEL, выглядят красными, так как используемый набор TUNEL помечен TMR. Красные клетки не располагаются в один ряд, а образуют кластеры в виде подобных структур. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости работать в ламинарном шкафу для культур тканей по мере возможности и минимизировать время воздействия на ткани головного мозга потенциальных загрязнителей, таких как бактерии или грибки.С помощью данной процедуры к этим срезам могут быть применены другие методы, включая биохимический и электрофизиологический анализы, для получения дополнительных данных о содержании белков, а также о возбудимости нейронов. Этот метод был изначально разработан для изучения эффекта быстрого опосредованного гибели клеток в клетках Перкина, несущих мутации, влияющие на быстрый путь. Клетки Периа редко выживают в первичной культуре.Таким образом, данная процедура оказалась наиболее эффективным экспериментальным подходом. Надеюсь, что после просмотра этого видео у вас сложится четкое представление о том, как готовить срезы головного мозга и как можно изучать влияние апатических стимулов на различные типы клеток мозга.

organotypic-cerebellar-cultures-apoptotic-challenges-and-detection

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Нейронауки

Live-ячейки изображения каспазы-3 опосредованного апоптоза в увековечены N19-олигодендроцитов культурах клеток с...

Мониторинг Расколотая активность каспазы-3 и Апоптоз Иммортализованные Олигодендроглиальные Клетки с использованием живых клеток и цифровой обработки изображений Cleaveable флуорогенных краски Подложки После калий-индуцированной деполяризацию мембраны

Мы представляем протокол, который позволяет просматривать и количественно ослов морфологии дендритных деревьев отдельных клеток Пуркинье, выращенных в культурах мозжечка органотипических срез. Этот протокол предназначен для поощрения исследований о механизмах развития Пуркинье дендритные клетки.

Анализ Пуркинье морфологии дендритных клеток в органотипической культур Slice

Это видео иллюстрирует технику получения мозжечковых органотипических срезов из мозга мышиного щенка и культивирования срезов в среде с добавлением питательных веществ и факторов роста для имитации развития мозжечка in vitro. Кроме того, специфические срезы мозжечка обрабатываются тестируемым соединением, а нейропротекторная способность соединения анализируется с помощью метода иммунофлуоресцентного окрашивания.

Анализ выживаемости клеток Пуркинье в органотипических культурах срезов мозжечка

Это видео демонстрирует метод идентификации нейронов из смешанной культуры гранулярных нейронов мозжечка и глиальных клеток с использованием двойного окрашивания флуоресцеином диацетатом (FDA) и йодидом пропидия (PI), где живые нейроны отображаются зеленым, а мертвые нейроны - красными.

Оценка жизнеспособности нейронов в культуре нейронов мозжечка с помощью двойного окрашивания

Мозжечка внешний слой гранул сайт крупнейшего транзитного усиления в развивающемся мозге. Здесь мы приводим протокол целевой генетической модификации к этому слою на пике распространения с использованием естественных условиях электропорации экс и культуры мозжечка ломтиками из эмбриональных день 14 куриных эмбрионов.

Экс Vivo культуры Чик мозжечка ломтиками и пространственно Целевые Электропорация ЗК прекурсоров

Этот протокол описывает, как точно измерить жизнеспособность нейронов с использованием двойного окрашивания флуоресцеина диацетата (FDA) и пропидиум-йодида (PI) в культивируемых нейронах гранул мозжечка, первичной нейрональной культуре, используемой в качестве модели in vitro в исследованиях нейронауки и нейрофармакологии.

Оценка жизнеспособности нейронов с помощью двойного окрашивания флуоресцеина диацетат-пропидиум в культуре нейробных гранул мозжечка

Этот протокол описывает простой метод для изоляции и культивирования мыши мозгового гранул нейронов (КСГН) от 6-7 день старого щенков, эффективное трансдукции КСГН потери и получить функция исследований и моделирования NMDA-индуцированной Эксайтотоксичность нейронов, Низкий калий индуцированной клеточную гибель, повреждение ДНК и оксидативного стресса, с использованием той же модели культуры.

Моделирования нейронов смерти и дегенерации в мышь первичной мозжечковой гранул нейронов

Здесь мы представляем метод подготовить organotypic срез культур от мыши мозжечка и миелиновой оболочкой, окрашивание, иммуногистохимия подходит для изучения механизмов миелинизации и remyelination в центральной нервной системе.

Подготовка и иммуноокрашивания Myelinating Organotypic мозжечка ломтик культур

Проведение экспериментов в пробирке, чтобы отразить в условиях vivo как можно более адекватно, не является легкой задачей. Использование первичных клеточных культур является важным шагом на пути к пониманию клеточной биологии в целом организме. В предоставленном протоколе описывается, как успешно расти и культуры эмбриональных нейронов мозжечка мыши.

Первичная культура нейронов, изолированных от эмбриональной мыши Cerebellum

Органотипические срезные культуры являются мощным инструментом для изучения нейроразвития или дегенеративных / регенеративных процессов. Здесь мы описываем протокол, который моделирует нейроразвитие смерти клеток Purkinje в мыши мозжечковой культуры ломтик. Этот метод может принести пользу исследованиям в нейропротекторных открытий наркотиков.

Purkinje Cell выживания в органотипической церебеллярной части культур

Мозжечковые клетки Пуркинье (ПК) особенно чувствительны к дефициту в ответе на повреждение ДНК. Представлен протокол визуальной оценки динамики ответа ПК на повреждение ДНК, который включает окрашивание связанных с белками поли(АДФ-рибозных) цепей в мозжечковых органотипических культурах.

Визуализация реакции на повреждение ДНК в клетках Пуркинье с использованием мозжечковых органотипических культур

Изучите метод органотипических культур мозжечка для исследования апоптоза у мышей дикого типа и мутантов. Этот подход позволяет анализировать влияние fast ligand на выживаемость нейронов с сохранением тканевой архитектуры.

Органотипической мозжечка культур: проблемы и апоптоза Обнаружение

Больше видео