Инженерно-биологической основе сосудистых трансплантатов использовании пульсирующего биореактора

Общая цель этой процедуры заключается в создании сосудистых трансплантатов на биологической основе с использованием системы пульсирующего биореактора. Это достигается путем подготовки биоразлагаемого каркаса из сетки PGA, где клетки будут расти рядом, и сборки их в камере биореактора. Затем каркасы помещаются с гладкомышечными клетками, а крышка с воздухом и питательной трубкой герметизирует камеру биореактора.

Затем биореактор подключается к проточной системе для обеспечения пульсирующего потока к сосудам в биореакторе. В реакторе из клеток вырастают сосуды, которые проходят иммунохимические, биохимические и механические испытания. Применение этого метода распространяется и на терапию ишемической болезни сердца, поскольку этот метод является перспективным подходом к регенерации имплантируемых сосудистых трансплантатов малого диаметра для артериального шунтирования.

Хотя этот метод может дать представление о сосудистой инженерии, он может быть применен к другим системам органов, таким как циклические физиологические силы. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности. Вам потребуется много практики, чтобы полностью овладеть навыками.

Впервые идея этого подхода пришла нам в голову, когда мы осознали важность применения физиологической механической стимуляции для регенерации инженерных конструкций. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как процесс управления биореактором сложен для изучения, потому что он состоит из множества этапов и может быть получен только путем детальной демонстрации. Для начала используйте дистиллированную воду для очистки 30-сантиметровых секций силиконовой трубки внутреннего диаметра три миллиметра и дайте ей высохнуть на воздухе.

С помощью ножниц вырезайте секцию сетки PGA размером 1,1 на восемь сантиметров для каждого куска трубки с помощью гемостата, чтобы сетка PGA к трубке со шовным материалом Dexon 6.0 завязала три хирургических узла и затем одинарными стежками с гемостатом, из закрепленной сетки получился каркас PGA. Промойте каркасы, сначала опустив их в один моляр гидроксида натрия на одну-две минуты, а затем три раза опустите в дистиллированную воду на две минуты на одно погружение. Промокните их насухо между стирками и дайте им высохнуть на воздухе в капюшоне в течение 15 минут после третьей стирки.

После высыхания зашить манжеты из дакрона по одному сантиметру на каждый конец сетки тремя стежками. Оставьте нахлест трубки на два-три миллиметра и не прокалывайте трубку. Обязательно оставьте около 15 сантиметров свободного шва для последующего использования в этом протоколе.

Все компоненты и инструменты биореактора предварительно автоматически клавируются. За сутки до начала культивирования биореактора, биореактор должен быть частично собран, погрузить в биореактор компоненты каркасов, то есть сетчатые силиконовые трубки, хирургические инструменты и тонкую проволоку длиннее длины биореактора в ванну с 70%-ным этанолом не менее чем на 30 минут во время погружения. С помощью проволоки протяните силиконовую трубку через боковые рычаги реактора.

Теперь выйдите из биореактора и прикрепите внутри каркасы PGA, закрепив манжеты из дакрона на кромках из расширенного стекла. Используйте излишки шва, чтобы завязать каждую манжету. Затем, используя соединители, прикрепите силиконовую трубку с одной стороны каркаса с одной парой рукавов биореактора и прикрепите трубку с другой стороны каркаса к двум другим рукавам.

Когда разъемы будут установлены, вытащите их из боковых рычагов и промойте биореактор этанолом. Оставьте реактор в замачивании по 10 минут с каждой стороны. Установите биореактор на несколько чашек Петри и промойте его с помощью культуры тканей.

Сортируйте воду. С помощью пипетки обязательно также промойте сетку и трубку. Теперь поместите стерильную мешалку в реактор для дальнейшего использования и высушите аппарат в течение ночи в колпаке с включенной воздуходувкой и выключенным ультрафиолетовым излучением.

Не наклоняйтесь над реактором, так как это может привести к загрязнению Во время настройки все разъемы необходимо протереть спиртом. Перед изготовлением атташе многие стыки укрепляются параформом, который перед нанесением необходимо пропитать в 70% этаноле. Так что имейте в избытке и то, и другое.

В качестве меры предосторожности поместите стерильную чашку Петри над каждым отверстием биореактора, чтобы защитить каркас PGA внутри от загрязнений. Теперь начните настройку с присоединения впрыскового порта к третьему неиспользуемому рукаву биореактора. Далее соедините мешок для внутривенных вливаний с проточной системой.

Установив трубку из моржа, завяжите синий конец как можно ближе к Y-образному соединению и зажмите трубку. Прикрепите красную трубку к дальнему концу пакета для внутривенных вливаний. Затем прикрепите белую трубку к одной стороне проточной системы.

Вставьте трехсторонний стопорный кран в систему потока. Прикрепите один конец трубки датчика давления к запорному крану, а другой конец прикрепите к среднему отверстию пакета для внутривенных вливаний. Теперь, чтобы частично заполнить проточную систему и проверить наличие утечек, добавьте в пакет для внутривенных вливаний 350 миллилитров PBS и 1% грибковой зоны.

Используя шприц объемом 60 миллилитров до или после подключения к проточной системе, отрегулируйте запорный кран для контроля направления потока PBS и сожмите мешок, чтобы промыть систему. Этот шаг может быть выполнен как до, так и после посадки в ячейку. Теперь клетки могут быть размещены в биореакторе.

В этом примере ресуз суспендирует 8 миллионов SM-клеток, что составляет примерно одну конфлюентную T 75 в 1,25 миллилитрах среды, и равномерно капает их на каркас PGA от дакронового перехода к дакроновому переходу. После добавления ячеек протрите ободок биореактора спиртом. Избегайте зависания над реактором.

Далее аккуратно соберите силиконовую крышку-пробку. Убедитесь, что нижняя часть крышки не подвергается воздействию во время ее извлечения из пакета для автоклава или во время любого из следующих этапов крепления. Сначала прикрепите отверстие для инъекций к питательной трубке на штекерном разъеме.

Во-вторых, прикрепите фильтры из ПТФЭ 0,20 микрона к каждому из трех аэропортов. В-третьих, запишите на пленку отверстие для впрыска. Вставьте собранную силиконовую крышку пробки в стеклянный биореактор.

Следите за тем, чтобы подающая трубка не касалась установленных лесов PGA. Затем запечатайте параформой. Теперь подключите биореактор к проточной системе и поместите биореактор и проточную систему в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия.

В течение 25-30 минут реактор должен быть установлен на боку и вращаться каждые пять минут. Далее, еще находясь в инкубаторе, заполните камеру биореактора 400 миллилитрами от четырех до 10 питательных сред с помощью насоса через питательную трубку. Теперь инкубируйте засеянные каркасы без какой-либо пульсирующей откачки в течение шести-семи дней при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

Нет необходимости в смене среды или приеме добавок витамина С в течение этого времени перед включением насоса, осмотрите трубки на предмет утечек или перегибов. Затем отрегулируйте скорость насоса, чтобы поддерживать диапазон давления от отрицательных 30 до 270 миллиметров ртутного столба. Ежедневно контролируйте и поддерживайте это давление на протяжении всей культуры.

Подмену среды и добавление аскорбиновой кислоты следует проводить два раза в неделю, пока каркас растет с помощью пульсирующей откачки, чтобы сначала подать свежую среду, прикрепить отверстие для впрыска и фильтр из ПТФЭ к крышкам подачи как для смены среды, так и для утилизации отходов среды. Затем плотно поместите подающую трубку в двухнаправленный насос и вставьте один конец в подающее отверстие биореактора, а другой конец в загрузочную крышку. Теперь потихоньку начинаем откачивать 200 миллилитров среды.

Постепенно скорость насоса можно увеличивать. Затем подсоедините новую питательную трубку и медленно начните сцеживать 200 миллилитров свежей среды. Чтобы добавить аскорбиновую кислоту в реактор, удалите 25 миллилитров среды с помощью стерильного 30-миллилитрового шприца.

Добавьте пять миллилитров стерильного раствора аскорбиновой кислоты и затем верните 25 миллилитров. Сосуды среднего проектирования будут казаться непрозрачными и достигать толщины стенки примерно 250 микрон после восьминедельного культивирования. В пульсирующих условиях окрашивание гемата, тоина и эозина сконструированных сосудов показывает изменения морфологии тканей со временем и с пульсацией.

Просветная сторона сосудов обозначена пятном L masson's tri CHRO. Для коллагена видно, что четырехнедельный импульсный сосуд имеет больше коллагена, чем его непульсовый аналог, белые стрелки указывают на оставшиеся фрагменты PGA в сосудах к 12 неделям. Иммунохимический анализ показывает экспрессию раннего маркера гладкой мускулатуры альфа-актина, промежуточного маркера гладкой мускулатуры cal poin one и позднего маркера гладкой мускулатуры тяжелой цепи миозина.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что после этой процедуры все должно быть выполнено максимально чисто и безупречно. Другие методы, такие как модификация просвета сконструированных сосудов, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как важность модификации поверхности люмина при обслуживании спроектированных сосудов во время исследований in vivo. После его разработки.

Этот метод проложил путь исследователям в области тканевой инженерии, особенно сосудистой инженерии, к изучению потенциальных средств лечения заболеваний коронарных артерий на животных моделях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить имплантируемые инженерные сосудистые трансплантаты с помощью динамической почтовой культуры. Не забывайте, что работа с гидроксидом натрия может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует использовать такие меры предосторожности, как защита глаз и лабораторный халат.