Инженерно-биологической основе сосудистых трансплантатов использовании пульсирующего биореактора

Общая цель данной процедуры заключается в создании биоинженерных сосудистых графтов с использованием пульсирующей системы биореактора. Это достигается путем изготовления биоразлагаемого каркаса из сетки ПГК (PGA), на которой будут расти клетки, и их размещения в камере биореактора. Затем каркасы засеивают гладкомышечными клетками, после чего камера биореактора герметично закрывается крышкой с трубками для подачи воздуха и питательной среды.

Затем биореактор подключают к системе потока для обеспечения пульсирующего кровотока в сосудах внутри биореактора. В реакторе клетки развиваются в сосуды, которые проходят иммунохимические, биохимические и механические испытания. Значимость данной методики распространяется на терапию ишемической болезни сердца, поскольку этот метод является перспективным подходом к регенерации имплантируемых сосудистых графтов малого диаметра для артериального шунтирования.

Хотя этот метод позволяет получить ценные сведения в области сосудистой инженерии, его можно применять и к другим системам органов, подвергающимся циклическим физиологическим нагрузкам. Как правило, новичкам в этом методе бывает трудно. Для полного освоения данных навыков потребуется длительная практика.

Идея данного подхода возникла у нас, когда мы осознали важность применения физиологической механической стимуляции для регенерации инженерных конструктов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как процесс использования биореактора сложно освоить из-за большого количества этапов, и он может быть изучен только при детальном показе. Для начала промойте дистиллированной водой отрезки силиконовой трубки внутренним диаметром 3 мм и длиной 30 см, затем дайте им высохнуть на воздухе.

С помощью ножниц вырежьте фрагмент сетки из PGA размером 1,1 сантиметра на восемь сантиметров для каждого отрезка трубки. Используя гемостат, прикрепите сетку из PGA к трубке нитью Dexon 6.0, завязав три хирургических узла, и закрепите одиночными стежками с помощью гемостата; закрепленная сетка образует скаффолд из PGA. Промойте скаффолды, сначала погрузив их в 1 M раствор гидроксида натрия на одну-две минуты, а затем трижды погрузив в дистиллированную воду по две минуты за каждое погружение. Промакивайте их насухо между промывками и оставьте высыхать на воздухе в вытяжном шкафу на 15 минут после третьей промывки.

После высыхания пришейте к каждому концу сетки манжеты из дакрона длиной один сантиметр, используя три стежка. Оставьте нахлест трубки в две-три миллиметра и не прокалывайте трубку. Обязательно оставьте около 15 сантиметров свободного шовного материала для последующего использования в данном протоколе.

Все компоненты и инструменты биореактора предварительно автоклавируют. За день до начала культивирования в биореакторе его необходимо частично собрать, погрузив компоненты биореактора — скаффолды, сетку, силиконовые трубки, хирургические инструменты и тонкую проволоку, длина которой превышает длину биореактора, — в 70% раствор этанола минимум на 30 минут. С помощью проволоки проденьте силиконовые трубки через боковые патрубки реактора.

Теперь извлеките биореактор и закрепите внутри него скаффолды из PGA, зафиксировав манжеты из дакрона на расширенных стеклянных краях. Используйте излишки шовного материала, чтобы плотно завязать каждую манжету. Затем с помощью коннекторов подсоедините силиконовую трубку с одной стороны скаффолда к одной паре выводов биореактора, а трубку с другой стороны скаффолда — к двум другим выводам.

После установки коннекторов извлеките их из боковых отводов и промойте биореактор этанолом. Оставьте реактор замачиваться на 10 минут с каждой стороны. Поместите биореактор на чашки Петри и промойте его питательной средой для культур тканей.

Промойте воду. С помощью пипетки обязательно промойте также сетку и трубки. Затем поместите в реактор стерильный магнитный перемешиватель для последующего использования и оставьте аппарат для просушки на ночь в вытяжном шкафу с включенным обдувом и выключенным УФ-излучением.

Не наклоняйтесь над реактором, так как это может привести к загрязнению. Во время подготовки все соединители необходимо протереть спиртом. Перед соединением многие стыки следует укрепить параформом, который перед применением необходимо замочить в 70% ethanol. Поэтому позаботьтесь о достаточном количестве обоих компонентов.

В качестве меры предосторожности накройте каждое отверстие биореактора стерильной чашкой Петри, чтобы защитить находящийся внутри каркас из ПГК от загрязнений. Теперь приступите к установке, присоединив инжекционный порт к третьему свободному отводу биореактора. Затем подключите инфузионный пакет к системе потока.

Используя комплект трубок «walrus», перевяжите синий конец как можно ближе к Y-образному соединению и зажмите трубку зажимом. Подсоедините красную трубку к дальнему концу инфузионного пакета. Затем подсоедините белую трубку к одной стороне системы потока.

Вставьте трехходовой кран в систему потока. Присоедините один конец трубки датчика давления к крану, а другой конец — к среднему отверстию инфузионного пакета. Теперь, чтобы частично заполнить систему потока и проверить ее на наличие утечек, добавьте в инфузионный пакет 350 миллилитров PBS и 1% Fungizone.

Используя шприц объемом 60 миллилитров до или после подключения к системе потока, поверните кран для управления направлением потока PBS и сожмите пакет, чтобы промыть систему. Этот этап можно выполнить как до, так и после посадки клеток. Теперь можно приступить к посадке клеток в биореактор.

В данном примере ресуспендируйте 8 миллионов клеток SM (что примерно соответствует одному конфлюэнтному флакону T 75) в 1,25 миллилитрах среды и равномерно нанесите их капельно на скаффолд из PGA, от одного дакронного соединения к другому. После добавления клеток протрите край биореактора спиртом. Избегайте наклона над реактором.

Затем аккуратно соберите крышку с силиконовой пробкой. Следите за тем, чтобы нижняя часть крышки не подвергалась воздействию внешней среды при извлечении ее из автоклавного пакета или на любом из последующих этапов сборки. Сначала присоедините порт для инъекций к подающей трубке с помощью штекерного разъема.

Во-вторых, установите ПТФЭ-фильтры с размером пор 0,20 мкм на каждый из трех портов. В-третьих, герметизируйте порт для инъекций. Вставьте собранную крышку из силиконовой пробки в стеклянный биореактор.

Убедитесь, что питательная трубка не касается установленных скаффолдов из ПГА. Затем герметизируйте систему парафильмом. Теперь подключите биореактор к системе подачи потока и поместите биореактор вместе с системой потока в инкубатор при температуре 37 °C.

В течение 25–30 минут реактор необходимо положить на бок и поворачивать каждые пять минут. Затем, не вынимая из инкубатора, заполните камеру биореактора 400 milliliters среды для культивирования 4:10 с помощью насоса через подающую трубку. После этого инкубируйте заселенные скаффолды без пульсирующей перекачки в течение шести–семи дней при 37 °C и 5% carbon dioxide.

В этот период замены среды или добавления витамина C не требуется; перед включением насоса проверьте трубки на наличие утечек или перегибов. Затем отрегулируйте скорость работы насоса так, чтобы поддерживать диапазон давления от -30 до 270 миллиметров ртутного столба. Контролируйте и поддерживайте это давление ежедневно на протяжении всего периода культивирования.

Смену среды и добавление аскорбиновой кислоты следует проводить дважды в неделю во время роста скаффолда с использованием пульсирующего насоса для подачи свежей среды; для этого сначала закрепите инъекционный порт и PTFE-фильтр на крышках для подачи среды, которые будут использоваться как для замены среды, так и для удаления отработанной среды. Затем плотно установите трубку подачи в двунаправленный насос, вставив один ее конец в порт подачи биореактора, а другой — в крышку для подачи. Теперь медленно начните откачивать 200 milliliters среды.

Постепенно увеличьте скорость работы насоса. Затем подсоедините новую трубку подачи и медленно начните перекачивать 200 milliliters свежей среды. Чтобы добавить аскорбиновую кислоту в реактор, удалите 25 milliliters среды с помощью стерильного шприца объемом 30 milliliters.

Добавьте пять миллилитров стерильного раствора аскорбиновой кислоты, затем верните 25 миллилитров среды. Созданные биоинженерные сосуды станут непрозрачными, а толщина их стенки достигнет примерно 250 мкм после восьми недель культивирования. При пульсирующих условиях окрашивание гематоксилином и эозином биоинженерных сосудов демонстрирует изменения морфологии тканей с течением времени и в зависимости от пульсации.

Просвет сосудов отмечен буквой L; окрашивание по Массону (трихром). Коллаген виден на снимках: в сосудах, подвергшихся пульсации в течение четырех недель, коллагена больше, чем в контрольных сосудах без пульсации. Белые стрелки указывают на оставшиеся фрагменты ПГК в сосудах к 12 неделе. Иммунохимический анализ показывает экспрессию раннего маркера гладких мышц альфа-актина, промежуточного маркера гладких мышц кальпонина-1 и позднего маркера гладких мышц тяжелой цепи миозина. При должном освоении данной методики выполнение процедуры занимает от семи до восьми часов.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости соблюдения максимальной чистоты и стерильности на всех этапах. Для ответов на дополнительные вопросы, такие как значимость модификации поверхности просвета для сохранения жизнеспособности инженерных сосудов в ходе исследований in vivo, могут быть применены другие методы, например, модификация просвета созданных сосудов после их разработки.

Этот метод открыл исследователям в области тканевой инженерии, особенно в сосудистой инженерии, путь к изучению потенциальных способов лечения заболеваний коронарных артерий на моделях животных. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать имплантируемые инженерные сосудистые графты с помощью динамического посткультивирования. Не забывайте, что работа с гидроксидом натрия может быть опасной, поэтому при выполнении данной процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование защитных очков и лабораторного халата.