Инженерно-биологической основе сосудистых трансплантатов использовании пульсирующего биореактора

Общая цель данной процедуры заключается в создании биологических сосудистых графтов с использованием системы пульсирующего биореактора. Это достигается путем изготовления биоразлагаемого каркаса из сетки PGA, на которой будут расти клетки, и его размещения в камере биореактора. Затем в каркасы заселяют гладкомышечные клетки, после чего камера биореактора герметизируется крышкой с трубками для подачи воздуха и питательной среды.

Затем биореактор подключают к системе потока для обеспечения пульсирующего кровотока в сосудах внутри биореактора. В реакторе клетки развиваются в сосуды, которые проходят иммунохимические, биохимические и механические испытания. Значимость данной методики распространяется на терапию ишемической болезни сердца, поскольку этот метод представляет собой перспективный подход к регенерации имплантируемых сосудистых графтов малого диаметра для артериального шунтирования.

Хотя данный метод позволяет глубже понять принципы сосудистой инженерии, его можно применять и к другим системам органов, подвергающимся циклическим физиологическим воздействиям. Как правило, новичкам в этом методе бывает трудно. Для полного освоения данных навыков потребуется длительная практика.

Идея данного подхода возникла у нас, когда мы осознали важность применения физиологической механической стимуляции для регенерации инженерных конструкций. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как процесс работы с биореактором сложно освоить самостоятельно из-за большого количества этапов; навыки приобретаются только в ходе детальной демонстрации. Для начала используйте дистиллированную воду для очистки отрезков силиконовой трубки длиной 30 сантиметров и внутренним диаметром три миллиметра, после чего дайте им высохнуть на воздухе.

С помощью ножниц вырежьте фрагмент сетки из ПГК размером 1,1 см на 8 см для каждого отрезка трубки. Используя гемостат, прикрепите сетку из ПГК к трубке швом Dexon 6.0, завязав три хирургических узла, и закрепите одиночными стежками с помощью гемостата; таким образом фиксированная сетка образует каркас из ПГК. Промойте каркасы, сначала погрузив их в 1 M раствор гидроксида натрия на одну-две минуты, а затем трижды погрузив в дистиллированную воду по две минуты за каждое погружение. Промакивайте их между промывками и оставьте до полного высыхания на воздухе в вытяжном шкафу на 15 минут после третьей промывки.

После высыхания пришейте дакроновые манжеты длиной 1 cm к каждому концу сетки с помощью трех стежков. Оставьте нахлест трубки в 2–3 mm; не прокалывайте трубку. Обязательно оставьте около 15 cm свободного шовного материала для последующего использования в данном протоколе.

Все компоненты и инструменты биореактора предварительно автоклавируют. За день до начала культивирования в биореакторе его необходимо частично собрать, погрузив компоненты биореактора, скаффолды, сетку, силиконовые трубки, хирургические инструменты и тонкую проволоку длиной более длины биореактора в 70% этанол минимум на 30 минут. С помощью проволоки проденьте силиконовые трубки через боковые отводы реактора.

Теперь извлеките биореактор и закрепите внутри него скаффолды из PGA, зафиксировав манжеты из дакрона на расширенных стеклянных краях. Используйте излишки шовного материала, чтобы плотно завязать каждую манжету. Затем с помощью коннекторов подсоедините силиконовую трубку с одной стороны скаффолда к одной паре рычагов биореактора, а трубку с другой стороны скаффолда — к двум другим рычагам.

После установки коннекторов вытяните их из боковых отводов и промойте биореактор этанолом. Оставьте реактор для замачивания на 10 минут с каждой стороны. Поместите биореактор на чашки Петри и промойте его питательной средой для культур тканей.

Промойте систему водой. С помощью пипетки обязательно промойте также сетку и трубки. Затем поместите стерильный магнитный якорь в реактор для последующего использования и просушите установку в вытяжном шкафу в течение ночи при включенном вентиляторе и выключенном УФ-излучении.

Не наклоняйтесь над реактором, так как это может привести к загрязнению. Во время подготовки все соединители необходимо протереть спиртом. Перед соединением многие стыки укрепляют параформом, который перед нанесением следует замочить в 70% этаноле. Поэтому позаботьтесь о достаточном количестве обоих веществ.

В качестве меры предосторожности накройте каждое отверстие биореактора стерильной чашкой Петри, чтобы защитить находящийся внутри скаффолд из PGA от загрязнений. Приступайте к установке, присоединив инъекционный порт к третьему свободному отводу биореактора. Затем подсоедините пакет с инфузионным раствором к системе потока.

С помощью набора трубок «walrus» перевяжите синий конец как можно ближе к Y-образному соединению и зажмите трубку зажимом. Подсоедините красную трубку к дальнему концу инфузионного пакета. Затем подсоедините белую трубку к одной стороне системы потока.

Вставьте трехходовой кран в систему потока. Подсоедините один конец трубки датчика давления к крану, а другой конец — к среднему отверстию инфузионного пакета. Затем, чтобы частично заполнить систему потока и проверить ее на герметичность, добавьте в инфузионный пакет 350 milliliters PBS и 1% fungi zone.

Используя шприц объемом 60 мл до или после подключения к системе потока, отрегулируйте трехходовой кран для управления направлением потока PBS и сожмите пакет, чтобы промыть систему. Этот этап можно выполнить как до, так и после посева клеток. Теперь можно приступить к посеву клеток в биореактор.

В данном примере ресуспендируйте 8 миллионов клеток SM (что примерно соответствует одному конфлюентному флакону T 75) в 1,25 миллилитрах среды и равномерно нанесите их по каплям на скаффолд из PGA от одного дакронового соединения до другого. После добавления клеток протрите ободок биореактора спиртом. Старайтесь не наклоняться непосредственно над реактором.

Затем осторожно соберите крышку с силиконовой пробкой. Следите за тем, чтобы нижняя часть крышки не подвергалась воздействию внешней среды при извлечении из автоклавного пакета или на любом из последующих этапов крепления. Сначала присоедините инжекционный порт к трубке подачи с помощью разъема «папа».

Во-вторых, установите ПТФЭ-фильтры с размером пор 0,20 мкм на каждый из трех портов. В-третьих, герметизируйте инъекционный порт. Вставьте собранную силиконовую пробковую крышку в стеклянный биореактор.

Убедитесь, что питательная трубка не касается установленных скаффолдов из PGA. Затем герметизируйте их парафильмом. Теперь подключите биореактор к системе потока и поместите биореактор и систему потока в инкубатор при температуре 37 °C.

В течение 25–30 минут реактор необходимо расположить на боку и поворачивать каждые пять минут. Затем, не вынимая из инкубатора, заполните камеру биореактора 400 milliliters питательной среды «four to 10», используя насос и подающую трубку. После этого инкубируйте заселенные скаффолды без пульсирующего перекачивания в течение шести–семи дней при 37 °C и 5% carbon dioxide.

В этот период замены среды или добавления витамина C не требуется. Перед включением насоса проверьте трубки на наличие утечек или перегибов. Затем отрегулируйте скорость работы насоса так, чтобы поддерживать диапазон давления от -30 до 270 мм рт. ст. Контролируйте и поддерживайте этот уровень давления ежедневно на протяжении всего периода культивирования.

Замену среды и добавление аскорбиновой кислоты следует проводить дважды в неделю в процессе роста скаффолда при пульсирующем перекачивании для подачи свежей среды; для этого сначала установите инъекционный порт и PTFE-фильтр на крышки для подачи, которые будут использоваться как для замены среды, так и для удаления отработанной среды. Затем надежно закрепите трубку для подачи в двухнаправленном насосе, вставив один ее конец в порт подачи биореактора, а другой — в крышку для подачи. После этого медленно начните откачивать 200 milliliters среды.

Постепенно увеличьте скорость работы насоса. Затем подсоедините новую подающую трубку и медленно начните перекачивать 200 milliliters свежей среды. Чтобы добавить аскорбиновую кислоту в реактор, удалите 25 milliliters среды с помощью стерильного шприца объемом 30 milliliters.

Добавьте пять миллилитров стерильного раствора аскорбиновой кислоты, а затем верните 25 миллилитров. Инженерные сосуды будут выглядеть непрозрачными и достигнут толщины стенки примерно 250 микрон после восьми недель культивирования. В условиях пульсации окрашивание инженерных сосудов гематоксилином и эозином демонстрирует изменения морфологии ткани с течением времени и в процессе пульсации.

Люминальная сторона сосудов отмечена буквой L; окрашивание по Массону (трихром). Коллаген виден более интенсивно в пульсирующих сосудах через четыре недели по сравнению с непульсирующими аналогами; белые стрелки указывают на остаточные фрагменты PGA в сосудах к 12 неделям. Иммунохимический анализ демонстрирует экспрессию раннего маркера гладкомышечных клеток альфа-актина, промежуточного маркера кальпонина-1 и позднего маркера гладкомышечных клеток тяжелой цепи миозина. При должном исполнении и наличии соответствующего опыта данная методика занимает от семи до восьми часов.

При выполнении данной процедуры крайне важно соблюдать максимальную чистоту и стерильность на всех этапах. Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о значимости модификации просвета искусственных сосудов для их сохранения при исследованиях in vivo, могут быть применены и другие методы, такие как модификация просвета созданных сосудов после их разработки.

Данный метод открыл исследователям в области тканевой инженерии, особенно в сосудистой инженерии, путь к изучению потенциальных способов лечения заболеваний коронарных артерий на моделях животных. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создать имплантируемые инженерные сосудистые трансплантаты с помощью динамического посткультивирования. Не забывайте, что работа с гидроксидом натрия может быть опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование защитных очков и лабораторного халата.