Lineage Маркировка данио рерио Клетки с лазерной Uncagable Fluorescein Декстран

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы пометить клетки в эмбрионе рыбки данио. Это достигается путем предварительного синтеза флуоресцеина в клетке и введения его эмбрионам рыбок данио. Затем эмбрионы помещаются в агарро, чтобы клетки, которые должны быть помечены, были доступны.

Затем с помощью ультрафиолетового лазера активируется флуоресцеин в клетке в выбранных клетках эмбриона. Наконец, эмбрионы собирают после того, как они развились до желаемой стадии, и меченые клетки обнаруживаются по отношению к маркерам конкретных линий. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают судьбу отобранных клеток в эмбрионах с помощью фотоизвлечения клеток и иммунофлуоресцентной микроскопии.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как фотоконверсия Cade, заключается в том, что многоцветная иммунофлуоресценция может обнаруживать флуоресцеин без клеток в дополнение к другим специфическим антителам, связанным с клеточными связями. Чтобы ввести флюоресцеин декстрана в клетке эмбрионам рыбок данио, сначала синтезируйте его и приготовьте 1% веса на объем. Складируйте аликвоты в соответствии с прилагаемым письменным протоколом.

Далее разбавляем аликвоту, один к пяти или один к 10 в 0,2 молярного хлористого калия. Далее введите от 0,5 до одного нанолитра раствора флуоресцеина в клетку эмбрионов одной клеточной стадии. При использовании инжектора под давлением после инъекции кладки эмбрионов необходимо держать в темноте при температуре 28,5 градусов Цельсия, чтобы уменьшить количество неспецифических клеток на желаемой стадии развития.

Вручную удалите чун из эмбрионов, обезболите эмбрионы в 4%-ной трике, чтобы установить равновесие эмбрионов, 0,8% расплавите арос в термоблоке при температуре 50 градусов Цельсия в течение не менее 15 минут. Затем охладите пробирку в руке в течение примерно 30 секунд Перед добавлением эмбрионов с помощью стеклянной пипетки наберите один эмбрион в минимальном количестве воды и выпустите его в арос. Выведите зародыш из пробирки пипеткой вместе с примерно 50 микролитрами ароса и выдавите содержимое в центр чашки Петри размером 35 на 10 миллиметров.

С помощью пластиковой нити быстро сориентируйте эмбрион с расклеиваемыми клетками лицевой стороной вверх. Дайте аросу полностью застыть и наполните блюдо. На две трети заполненные яичной водой, содержащей 4% трики и 0,003% ПТУ, хранят эмбрионы в легком герметичном ящике до тех пор, пока они не будут помещены в клетку.

Для лазерного воздействия на клетки флюоресцеина декстрана используется составной микроскоп с объективом с 40-кратным погружением в воду. Мы используем лазер для инструментов фотоники с ячейкой красителя 365 нм и дихроичным зеркалом с расщеплением на 70% 30% перед раскалыванием. Лазер должен быть сделан паренно-фокальным по отношению к объективу и ослаблен до соответствующей мощности для фокусировки лазера.

Поместите предметное стекло под объектив и сфокусируйте объектив до тех пор, пока на предметном стекле не станут видны царапины. Отрегулируйте лазерный аттенюатор до тех пор, пока лазер не издаст хорошо видимую царапину на зеркале одним импульсом, регулируйте фокус объектива вверх и вниз. Если лазер может оставить царапину, когда объектив не сфокусирован, отрегулируйте фокус лазера на одну четверть.

Поверните вверх или вниз. Повторяйте до тех пор, пока лазер не сможет поцарапать зеркало. Только когда объектив сфокусирован, поместите установленный эмбрион под объектив и сосредоточьтесь на области, которую нужно освободить для снятия с клетки.

Сфокусируйтесь на интересующей вас клетке и пульсируйте ее от 10 до 20 раз с частотой от двух до трех герц. После снятия каркаса. Освободите эмбрион, отклеив аэрос щипцами и поместив их в яичную воду, содержащую 0,003% эмбрионов PTU Fix в фиксаторе антител, на два-четыре часа при комнатной температуре или на ночь при температуре четыре градуса Цельсия.

Снимите фиксатор и замените его на 100% метанол. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре. Затем удалите метанол и замените его свежим 100% метанолом.

Храните эмбрионы в метаноле при температуре минус 20 градусов Цельсия не менее 30 минут. Хранить в метаноле можно до двух недель, прежде чем эпитопы начнут разлагаться. Регидратируйте эмбрионы с помощью пятиминутных промываний при комнатной температуре 75% метанола 25% одного х фосфатного буферного раствора с 0,1% 20% 20% 50% метанола 50% XPBS для 20, затем 25% метанола, 75% для одного XPBS для 20 промывки три раза в течение пяти минут в одном подростке XPBS 20.

Если эмбрионы старше 24 часов, пропитайте их 10 микрограммами на миллилитр. Время проникновения протеиназы К в один из подростков XPBS 20 зависит от стадии эмбриона. Достаточно пяти минут в протеазе К.

Если эмбрионы находятся в период от 24 до 48 часов после оплодотворения, для более старых личинок может потребоваться больше времени. Повторно зафиксируйте фиксатор антител на 20 минут при комнатной температуре. Промойте эмбрионы пять раз в течение пяти минут в одном XPBS tvone 20 при комнатной температуре.

Затем выдерживают в блочном растворе в течение одного-двух часов при комнатной температуре. Разведите первичные антитела в блокирующем растворе. Затем инкубируйте эмбрионы в течение ночи при четырех градусах Цельсия в растворе, содержащем первичные антитела, на следующее утро, одновременно промывая эмбрионы четыре раза в одном XPBS tritton X 100, разбавляя флуоресцентно меченые вторичные антитела в блокирующем растворе.

Инкубируйте эмбрионы в течение ночи при четырех градусах Цельсия в растворе, содержащем вторичные антитела. После четырехкратной промывки в одном XPBS Triton X 100 очистите эмбрионы в 50% глицерине 50% одном XPBS в течение не менее двух часов при комнатной температуре. Затем удалите глицериновую смесь PBS и добавьте 100% глицерин, инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

Результаты репрезентации для контроля и фото личинок без клеток представлены в виде конфокальных проекций. Контрольным эмбрионам вводили флюоресцеин в клетке, но не подвергали фотоотделению через 48 часов после оплодотворения. Контрольный эмбрион проявляет мечение GFP в шишковидном комплексе.

Некоторая точечная фоновая маркировка, но локализованное накопление меченого флуоресцеина не обнаруживается. На фото эмбрионов без клеток видно явное накопление флуоресцеина в некоторых клетках, меченных GFP. Это потомки клеток, на которые была сделана фотография в клетке на 24 часа раньше, с незначительными изменениями.

Эта процедура может быть использована для линейной маркировки практически любой ткани эмбриона данио-рерио до 48 часов после оплодотворения.