Индукция аллоантигена конкретных анергии в населенных мононуклеарных клеток периферической крови путем стимуляции аллоантигена с сопредседателями стимулирующий сигнал блокады

Общая цель следующего эксперимента заключается в активации аллоспецифических Т-клеток донора-реципиента путем стимуляции ex vivo антигенами реципиента в присутствии антител, блокирующих костимуляцию Т-клеток антигенпрезентирующими клетками через рецептор CD 28. Это достигается путем предварительного выделения PBMC от двух разных здоровых доноров. Затем создается общая активирующая алло-кокультура путем инкубации популяций PBMC, несовместимых по HLA, в присутствии моноклональных антител к лигандам B 7.1 и B 7.2 для блокирования стимуляции CD 28.

Затем эффективность аллоэнергизации измеряется с помощью первичной и вторичной реакции смешанных лимфоцитов (РСЛ). Наконец, аллоспецифичность аллоэнергизации оценивается путем определения ответов на антигены третьего лица и специфических ответов на CMV. Полученные результаты показывают, что Т-клетки донора становятся гипореактивными к последующей аллоантигенной стимуляции, в то время как неаллореактивные Т-клетки донора остаются сохранными и функциональными.

Мы успешно применили эту стратегию в предыдущих и текущих пилотных клинических исследованиях по инфузии алло-энергизированных Т-клеток донора во время и после трансплантации стволовых клеток при несовместимости по HLA. Было отмечено более эффективное восстановление иммунитета, меньшее количество инфекций, а также менее тяжелое течение острой и хронической болезни «трансплантат против хозяина» по сравнению с историческим контролем реципиентов неманипулированных трансплантатов при несовместимости по HLA. Основным преимуществом стратегии алло-анодизации является минимизация побочных эффектов, поскольку данный метод не снижает специфический Т-клеточный ответ на патогены или опухолеассоциированные антигены и не элиминирует регуляторные Т-клетки CD4 из пула Т-клеток донора. Демонстрацию процедуры проведет Кристин Вин, научный сотрудник нашей лаборатории. Первый шаг заключается в заборе крови у двух здоровых добровольцев-доноров.

Клетки одного донора будут использоваться в качестве респондеров, а клетки другого донора — в качестве стимуляторов. Затем выделите PBMC из крови методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием fial pac. Окрасьте небольшое количество клеток трипановым синим и подсчитайте количество жизнеспособных PBMC с помощью гемоцитометра reus.

Распределите PBMC от каждого донора по 10 мл полной питательной среды в отдельные конические пробирки объемом 15 мл, чтобы достичь концентрации 1 миллион жизнеспособных клеток на миллилитр. Назначьте одну пробирку с PBMC донора в качестве стимуляторов, а другую — в качестве респондентов для создания кокультуры для массовой аллоактивации.

Добавьте 100 micrograms антител anti B 7.1 и anti B 7.2 в 15 milliliter пробирку, предназначенную для стимулятора. Осторожно перемешайте содержимое пробирки и инкубируйте в течение 30 minutes. После периода инкубации облучите PBMC стимулятора и перенесите их в T 25 50 cubic centimeter флакон для культивирования клеток с газопроницаемой крышкой.

Маркируйте колбу как «bulk allo coal culture». Затем добавьте в колбу 10 миллилитров ПБМК-респондеров от другого донора в концентрации 1 миллион на миллилитр в полной среде. Добавьте в колбу еще по 100 микрограммов антител antib 7.1 и Antib 7.2 и аккуратно перемешайте содержимое перед тем, как поместить колбу в вертикальном положении в инкубатор на 72 часа.

Затем облучите еще 10 миллионов PBMC стимулятора для создания объемного контрольного кокультивирования без блокирующих антител и перенесите их в культуральный флакон T 25 объемом 50 кубических сантиметров. Пометьте флакон как «объемное контрольное кокультивирование». Добавьте в флакон 10 миллилитров тех же PBMC респондера, что использовались для объемного аллоэнергизирующего кокультивирования, в концентрации 1 миллион на миллилитр в полной среде, и аккуратно перемешайте перед тем, как поместить флакон вертикально в инкубатор на 72 часа.

Следующим шагом является измерение функции пула алло-активированных донорских Т-клеток в тот же день, когда маркируются массовые кокультуры. Используйте 96-луночный U-образный планшет для проведения первичного MLR для каждой из трех измеряемых временных точек. Затем перелейте по 5 мл из каждой массовой контрольной и алло-активирующей кокультуры в пробирки объемом 15 мл.

Затем перенесите по 200 мкл клеточной суспензии из каждой пробирки в лунки трех пластин, создав трипликаты. Обозначьте эти лунки как «без костимуляционной блокады» или «no CSB» для клеток из общих контрольных холодных культур и «CSB» для клеток из общих аллоэнергетических холодных культур. Затем добавьте по 200 мкл полной среды в шесть лунок на каждой пластине в качестве отрицательного контроля.

Наконец, добавьте по 200 µL PBS во все пустые лунки для уменьшения испарения и поместите планшеты в инкубатор. Через 72 часа после создания объемных кокультур подготовьте по одному 96-луночному планшету UBO для вторичного MLR для каждой из трех измеряемых временных точек. Чтобы подготовить клетки-респондеры для вторичного MLR, перенесите по 5 мл из каждой объемной контрольной и аллоэнергетической кокультуры в 15-мл пробирки и центрифугируйте их в течение 5–10 минут при 2000 об/мин при комнатной температуре. Затем промойте клетки еще дважды, осторожно аспирируя супернатанты, ресуспендируя осадки, добавляя по 10 мл полной среды в каждую пробирку и снова центрифугируя клетки после второго промывания.

Ресуспендируйте клетки в одном миллилитре полной среды. Используйте окрашивание трипановым синим для подсчета жизнеспособных клеток и доведите концентрацию до 1 миллиона жизнеспособных клеток-респондентов на миллилитр. Перенесите пипеткой по 100 мкл клеточной суспензии из каждой пробирки в лунки каждой планшеты в трех повторностях.

Сначала пометьте эти лунки как «первая сторона» или «стимуляция алло-сплава». Затем перенесите по 100 µL клеточной суспензии из каждой пробирки в еще три лунки на каждой планшете и пометьте эти лунки как «стимуляция CD 3/28 PBMC» от того же донора, который использовался для обеспечения PBMC стимулятора первой стороны для алло-реакции. Для клеток-стимуляторов во вторичном MLR используются активированные и контрольные ко-культуры; суспендируйте 10 миллионов PBMC донора первой стороны в концентрации 1 миллион на мл и облучите их.

Добавьте 100 µL облученных клеток-стимуляторов в лунки с пометкой fp allo restimulation на каждой вторичной планшете для MLR. Для положительного контроля добавьте по 1 µL моноклональных антител к CD3 и CD28 и 98 µL полной среды в лунки с пометкой CD 3 28 stimulation на каждом вторичном планшете для MLR. Кроме того, добавьте по 200 µL полной среды в шесть пустых лунок на каждом планшете в качестве отрицательного контроля и по 200 µL PBS во все остальные пустые лунки для уменьшения испарения.

Поместите планшеты в инкубатор. Следующим шагом является определение специфичности алло-ПБМК, выделенных из нового здорового донора, именуемого донором третьей стороны; они используются для проверки специфичности алло-процесса во вторичной реакции смешанно-клеточного лимфоцитоза (MLR). Ресуспендируйте ПБМК донора третьей стороны в концентрации 1 million cells per milliliter, облучите и распределите по трем 96-луночным планшетам для анализа специфичности вторичной MLR на третий, пятый и седьмой дни.

Для подготовки клеток-респондеров к вторичной реакции смешанных лимфоцитов (MLR) с целью измерения специфичности перенесите по пять миллилитров из каждой массивной контрольной и аллоактивирующей совместной культуры в пробирки объемом 15 миллилитров и центрифугируйте пробирки от 5 до 10 минут при 2000 об/мин. Затем промойте клетки дважды, осторожно аспирировав супернатанты, ресуспендировав осадки, добавив в каждую пробирку 10 миллилитров полной среды и повторно центрифугировав клетки после второй промывки. Ресуспендируйте клетки в одном миллилитре полной среды.

Используйте окрашивание трипановым синим для подсчета клеток и доведите концентрацию клеток до 1 миллиона жизнеспособных клеток-респондеров на миллилитр, затем перенесите по 100 µL клеточной суспензии из каждой пробирки в лунки каждого планшета в трех повторностях. Маркируйте эти лунки как TP или аллостимуляция сторонним донором. Затем добавьте 100 µL облученных стимулирующих клеток TP в лунки, маркированные как аллостимуляция TP.

Для дальнейшей проверки специфичности аллогенных ответов измеряют ответы на патогены после энергизации PBMC от доноров с ранее установленными пролиферативными ответами на CMV (метка 3 96). Подготовьте планшеты для вторичного M-L-R-C-M-V на третий, пятый и седьмой дни, и перенесите по 5 мл из каждой массивной контрольной и алло-энергизирующей ко-культуры в пробирки объемом 15 мл. Затем промойте, подсчитайте и ресуспендируйте клетки в полной среде с концентрацией 1 млн/мл; донесите по 100 мкл клеточной суспензии из каждой пробирки в три лунки каждого планшета и пометьте эти лунки как «стимуляция CMV».

Затем добавьте 0,1 мкл лизата CMV в 100 мкл полной среды в лунки, помеченные как «стимуляция CMV». Затем добавьте 200 мкл полной среды в шесть лунок на каждой планшете в качестве отрицательного контроля. В завершение добавьте 200 мкл PBS во все пустые лунки для уменьшения испарения и поместите планшеты в инкубатор для измерения пролиферации в первичной и вторичной MLR.

За 16 часов до сбора данных с планшетов добавьте один микрокюри тритированного тимидина в лунки с отрицательным контролем и в лунки с клетками. Соберите тимидин на один фильтр-мат для каждого планшета с помощью сборщика TomTec или аналогичного устройства. Сушите фильтр-маты в течение одного часа.

Затем поместите их в индивидуальные пакеты для образцов. Добавьте в каждый по пять миллилитров сцинтилляционной жидкости и загерметизируйте. Измерьте включение тритированного тимидина за последние 16 часов эксперимента, считав фильтры на микробета-сцинтилляционном счетчике Wallach или аналогичном приборе, используя ПБМК стимуляторов и респондеров с HLA-несовместимостью.

На этом рисунке видно, что наличие блокады костимуляции в первичном MLR снижает среднюю аллопролиферацию PBMC-респондеров на пятый день примерно до 30% от уровня, наблюдаемого в контрольном первичном MLR без блокады костимуляции. Это эквивалентно среднему ингибированию первичной аллопролиферации примерно на 70% на пятый день. Как показано на данном рисунке.

На этом рисунке видно, что при вторичном MLR пролиферация алло-активированных PBMC первого донора на пятый день обычно составляет 10–15% от уровня пролиферации контрольных PBMC. Это соответствует среднему ингибированию пролиферации на 85–90%, что демонстрирует гипореактивность алло-активированных PBMC к алло-стимуляторам первого донора. Как показано на данном рисунке, после освоения метода создание массовых кокультур с алло-активированными мононуклеарными клетками периферической крови донора занимает от двух до трех часов.

Данный подход может быть легко стандартизирован для клинического применения с целью получения донорских Т-клеток с пониженной аллореактивностью, но сохраненным патоген-специфическим иммунитетом. Такие клетки могут быть перенесены путем адоптивного переноса при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток для улучшения иммунной реконституции без развития выраженной реакции «трансплантат против хозяина». При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости работать быстро.

Это помогает сохранить жизнеспособность клеток и избежать неспецифической активации или потери антигенпрезентирующих клеток. При использовании криоконсервированных PBMC для стимуляторов или респондеров следует применять валидированный протокол реанимации замороженных клеток, обеспечивающий стабильно высокий выход жизнеспособных клеток. После просмотра этого видео вы должны получить четкое понимание того, как проводить аллоинизацию мононуклеарных клеток периферической крови человеческого донора и как выполнять анализы для оценки эффективности и специфичности этой процедуры; данная стратегия может быть использована для получения Т-клеток человеческого донора со сниженным аллоответом, что может быть применено в клинике для улучшения иммунной реконституции после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.