Индукция аллоантигена конкретных анергии в населенных мононуклеарных клеток периферической крови путем стимуляции аллоантигена с сопредседателями стимулирующий сигнал блокады

Общая цель следующего эксперимента заключается в активации аллоспецифических Т-клеток донора-реципиента путем стимуляции ex vivo аллоантигенами реципиента в присутствии антител, блокирующих костимуляцию Т-клеток антигенпрезентирующими клетками через рецептор CD 28. Для этого сначала выделяют PBMC от двух разных здоровых доноров. Затем создают общую аллоактивирующую кокультуру путем инкубации популяций PBMC, несовместимых по HLA, в присутствии моноклональных антител к лигандам B 7.1 и B 7.2 для блокирования стимуляции CD 28.

Затем эффективность аллоэнергизации измеряют с помощью первичных и вторичных реакций смешанных лимфоцитов или MLR. Наконец, аллоспецифичность аллоэнергизации определяют путем измерения ответов на антигены третьего лица и специфических ответов на CMV. Полученные результаты показывают, что Т-клетки донора становятся гипореактивными к последующей аллоантигенной стимуляции, в то время как неаллореактивные Т-клетки донора остаются неизменными и функциональными.

Мы успешно применили эту стратегию в предыдущих и текущих пилотных клинических исследованиях по инфузии алло-активированных Т-клеток донора во время и после трансплантации стволовых клеток при несовпадении HLA и наблюдали улучшение иммунной реконституции, снижение частоты инфекций, а также менее тяжелое течение острой и хронической болезни «трансплантат против хозяина» по сравнению с историческим контролем реципиентов неманипулированных трансплантатов при несовпадении HLA. Основным преимуществом стратегии алло-анодизации является минимизация побочных эффектов, так как данный метод не снижает патоген-специфические или опухоль-ассоциированные антиген-специфические Т-клеточные ответы и не элиминирует регуляторные Т-клетки CD4 из пула Т-клеток донора, что доказывает эффективность процедуры. Кристин Вин, научный сотрудник нашей лаборатории. Первый шаг заключается в заборе крови у двух здоровых добровольцев-доноров.

Клетки одного донора будут использоваться в качестве респондентов, а клетки другого донора — в качестве стимуляторов. Затем выделите PBMC из крови методом центрифугирования в градиенте плотности, используя fial pac. Окрасьте небольшое количество клеток трипановым синим и подсчитайте количество жизнеспособных PBMC с помощью гемоцитометра reus.

Расположите PBMC от каждого донора в отдельных конических пробирках объемом 15 миллилитров в полной питательной среде с концентрацией 1 миллион жизнеспособных клеток на миллилитр. Назначьте одну пробирку с PBMC донора в качестве стимуляторов, а другую — в качестве респондентов для создания массивной аллоэнергетизирующей кокультуры.

Добавьте 100 µg антител anti B 7.1 и anti B 7.2 в 15 мл пробирку, предназначенную для стимулятора. Осторожно перемешайте содержимое пробирки и инкубируйте в течение 30 минут. После периода инкубации облучите PBMC стимулятора и перенесите их в T 25 50 cm³ флакон для культивирования клеток с газопроницаемой крышкой.

Маркируйте колбу как «культура аллогенного угля в объеме». Затем добавьте в колбу 10 миллилитров PBMC-респондеров от другого донора в концентрации 1 миллион на миллилитр в полной среде. Добавьте в колбу еще по 100 микрограмм антител antib 7.1 и Antib 7.2 и осторожно перемешайте, после чего поместите колбу вертикально в инкубатор на 72 часа.

Затем облучите еще 10 миллионов PBMC-стимуляторов для создания общего контрольного кокультивирования без блокирующих антител, после чего перенесите их в T 25 флакон для культивирования клеток объемом 50 кубических сантиметров. Маркируйте флакон как «общий контрольный кокультивират». Добавьте во флакон 10 миллилитров тех же responder PBMC, которые использовались для общего аллоэнергетизирующего кокультивирования, из расчета 1 миллион на миллилитр в полной среде, и аккуратно перемешайте перед тем, как поставить флакон вертикально в инкубатор на 72 часа.

Следующим шагом является измерение функции пула аллоактивированных донорских T-клеток в тот же день, когда маркируются основные кокультуры: используйте 96-луночный планшет с U-образным дном для проведения первичной MLR для каждой из трех измеряемых временных точек. Затем перелейте по 5 мл из каждой основной контрольной кокультуры и аллоактивирующей кокультуры в пробирки объемом 15 мл.

Затем перенесите пипеткой по 200 µL клеточной суспензии из каждой пробирки в лунки трех пластин, используя трипликат для каждого образца. Обозначьте эти лунки как «без костимуляционной блокады» или «no CSB» для клеток из общих контрольных холодных культур и «CSB» для клеток из общих аллоэнергетизирующих холодных культур. После этого добавьте по 200 µL полной среды в шесть лунок на каждой пластине в качестве отрицательного контроля.

Наконец, добавьте по 200 µL PBS во все пустые лунки для уменьшения испарения и поместите планшеты в инкубатор. Через 72 часа после создания объемных кокультур подпишите один U-bottom 96-луночный планшет как «вторичный MLR» для каждой из трех измеряемых временных точек. Для подготовки клеток-респондеров к вторичному MLR перенесите по 5 мл из каждой объемной контрольной и аллоактивирующей кокультуры в пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте их в течение 5–10 минут при 2000 об/мин при комнатной температуре. Затем промойте клетки еще дважды: осторожно аспирируйте супернатант, ресуспендируйте осадок, добавьте в каждую пробирку 10 мл полной среды и снова центрифугируйте клетки после второй промывки.

Ресуспендируйте клетки в одном миллилитре полной среды. Используйте окрашивание трипановым синим для подсчета жизнеспособных клеток и доведите концентрацию до 1 миллиона жизнеспособных клеток-респондеров на миллилитр. Перенесите пипеткой по 100 µL клеточной суспензии из каждой пробирки в три лунки каждой планшетки.

Сначала пометьте эти лунки как стимуляция первой партии или аллостимуляция FP. Затем перенесите пипеткой 100 µL клеточной суспензии из каждой пробирки в другие три лунки на каждой планшете и пометьте эти лунки как стимуляция CD 3/28 PBMC от того же донора, который использовался для обеспечения PBMC стимулятора первой партии для аллореакции. Для клеток-стимуляторов во вторичном MLR используются энергизированные и контрольные кокультуры; суспендируйте 10 миллионов PBMC донора первой партии при концентрации 1 миллион на мл и облучите.

Добавьте 100 µL облученных клеток-стимуляторов в лунки, помеченные как fp allo restimulation, на каждой вторичной планшетке для смешанной лейкоцитарной реакции (MLR). В качестве положительного контроля добавьте по 1 µL моноклональных антител к CD3 и CD28, а также 98 µL полной среды в лунки, помеченные как CD 3 28 stimulation, на каждой вторичной планшетке MLR. Кроме того, добавьте по 200 µL полной среды в шесть пустых лунок на каждой планшетке в качестве отрицательного контроля и добавьте по 200 µL PBS во все остальные пустые лунки для уменьшения испарения.

Поместите планшеты в инкубатор. Следующим шагом является измерение специфичности: для проверки специфичности аллопроцесса во вторичной MLR используются алло-PBMC, выделенные из нового здорового донора, называемого донором третьей стороны. Суспендируйте PBMC донора третьей стороны в концентрации 1 миллион клеток на миллилитр, облучите и внесите в три 96-луночных планшета для вторичной MLR на специфичность с измерениями на третий, пятый и седьмой дни.

Чтобы подготовить клетки-респондеры для вторичного MLR с целью измерения специфичности, перенесите по 5 мл из каждой из массовых контрольной и алло-активирующей кокультур в пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте их в течение 5–10 минут при 2000 об/мин. Затем промойте клетки дважды: осторожно аспирируйте супернатанты, ресуспендируйте осадки, добавьте в каждую пробирку 10 мл полной среды и повторно центрифугируйте клетки после второй промывки. Ресуспендируйте клетки в 1 мл полной среды.

Используйте окрашивание трипановым синим для подсчета клеток и доведите концентрацию клеток до 1 миллиона жизнеспособных клеток-респондеров на миллилитр, затем перенесите пипеткой 100 µL клеточной суспензии из каждой пробирки в лунки каждого планшета в трех повторностях. Обозначьте эти лунки как TP (аллостимуляция сторонними клетками). Затем добавьте 100 µL облученных клеток-стимуляторов TP в лунки, помеченные как TP allo stimulation.

Для дальнейшей проверки специфичности аллогенных ответов измеряют ответы на патогены после энергизации PBMC от доноров с ранее установленными пролиферативными ответами на CMV; подпишите планшеты «label 3 96. Well plates secondary M-L-R-C-M-V day three, five and seven» и перенесите 5 mL из каждой из общей контрольной и алло-энергизирующей ко-культур в пробирки объемом 15 mL. Затем промойте, подсчитайте и ресуспендируйте клетки в концентрации 1 млн/mL в полной среде; пипеткой перенесите 100 µL клеточной суспензии из каждой пробирки в три лунки на каждом планшете и подпишите эти лунки как «CMV stimulation».

Затем добавьте 0,1 µL лизата CMV в 100 µL полной среды в лунки, помеченные как «стимуляция CMV». Далее добавьте по 200 µL полной среды в шесть лунок на каждой планшете в качестве отрицательного контроля. В завершение добавьте по 200 µL PBS во все пустые лунки для уменьшения испарения и поместите планшеты в инкубатор для измерения пролиферации при первичном и вторичном MLR.

За 16 часов до сбора данных с планшетов добавьте один микрокюри тритиевого тимидина в лунки с отрицательным контролем и лунки с клетками. Соберите тимидин на один фильтрующий мат для каждого планшета с помощью харвестера TomTec или аналогичного устройства. Высушите фильтрующие маты в течение одного часа.

Затем поместите их в индивидуальные пакеты для образцов. Добавьте в каждый по пять миллилитров сцинтилляционной жидкости и герметично закройте. Измерьте включение тритированного тимидина за последние 16 часов эксперимента, считав фильтры с помощью микробета-сцинтилляторного счетчика Wallach или аналогичного прибора, используя PBMC стимулятора и респондера с несовместимостью по HLA.

На данном рисунке видно, что наличие блокады костимуляции в первичной MLR снижает среднюю аллопролиферацию респондентных PBMC к пятому дню примерно до 30% от уровня, наблюдаемого в контрольной первичной MLR при отсутствии блокады костимуляции. Это соответствует среднему ингибированию первичной аллопролиферации примерно на 70% к пятому дню, как показано на данном рисунке.

На данном рисунке видно, что при вторичной MLR пролиферация аллоактивированных PBMC в ответ на стимуляцию аллогеничными клетками первой партии на пятый день обычно составляет 10–15% от уровня, наблюдаемого у контрольных PBMC. Это эквивалентно среднему ингибированию пролиферации на 85–90%, что демонстрирует гипореактивность аллоактивированных PBMC к аллостимуляторам первой партии. Как показано на рисунке, подготовка объемных кокультур с аллоактивированными мононуклеарными клетками периферической крови донора может занять от двух до трех часов.

Данный подход может быть легко стандартизирован для клинического применения с целью получения донорских T-клеток с пониженной аллореактивностью, но сохраненным патоген-специфическим иммунитетом. Такие клетки могут быть перенесены методом адаптивного переноса при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток для улучшения иммунной реконституции без развития выраженной реакции «трансплантат против хозяина». При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости работать быстро.

Это помогает сохранить жизнеспособность клеток и избежать неспецифической активации или потери антигенпрезентирующих клеток. При использовании криоконсервированных PBMC в качестве стимуляторов или респондеров следует применять валидированный протокол реанимации замороженных клеток, обеспечивающий стабильно высокий выход жизнеспособных клеток. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить аллоинизацию мононуклеарных клеток периферической крови человека и как выполнять анализы для оценки эффективности и специфичности этой процедуры; данная стратегия может быть использована для получения Т-клеток донора человека с пониженным аллогенным ответом, что может быть применено в клинике для улучшения иммунной реконституции после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.