Семь шагов к звездчатых клеток
10 мая 2011 г.
Здесь мы опишем метод изоляции печени звездчатые клетки печени мышей. Для очистки звездчатые клетки, печень мыши перевариваются На месте И В пробирке По проназы-коллагеназы лечения до центрифугирования в градиенте плотности. Этот метод дает очень чистый звездчатых клеток печени.
Общая цель данной процедуры — выделение звездчатых клеток печени из печени мыши. Это достигается путем предварительного проведения двух этапов перфузии печени мыши пищеварительными ферментами. После перфузии печень нарезают на мелкие кусочки для повышения эффективности последующего переваривания in vitro.
На заключительном этапе звездчатые клетки печени отделяют от других типов клеток печени с помощью центрифугирования в градиенте плотности. В итоге получают звездчатые клетки печени, чистоту которых можно оценить с помощью световой и иммунофлуоресцентной микроскопии. Процедуру продемонстрирует Патрик Мейер, аспирант лаборатории. В рамках подготовки к перфузии печени мыши раствором NC 2 сначала прогрейте буфер SC 1 и растворы для ферментативной перфузии на водяной бане при 37 °C.
Затем настройте перистальтический насос для обеспечения ламинарного потока со скоростью 6,5 мл/мин и уравновесьте силиконовую трубку насоса раствором SC one. Теперь убедитесь по отсутствию рефлексов, что анестезированная мышь находится в состоянии глубокой седации. После этого зафиксируйте мышь в положении на спине на подходящем основании.
С помощью ножниц и пинцета сделайте продольный разрез кожи живота и обнажите брюшину. Осторожно вскройте брюшину и переместите кишечник из брюшной полости на левую сторону животного, чтобы открыть доступ к воротной вене. Наиболее сложным этапом данной процедуры является зето-перфузия печени пищеварительными ферментами, которая будет продемонстрирована далее.
Далее важно использовать стереомикроскоп при введении канюли и внимательно следить за изменениями структур печени во время перфузии. Работая под стереомикроскопом, введите канюлю инфузионного набора в воротную вену. Начните перфузию печени 30 миллилитрами раствора SC one. Сразу после запуска потока вскройте нижнюю полую вену.
Успешное промывание печени характеризуется потерей цвета тканей печени; далее промойте печень 30 миллилитрами раствора Pronase E. После перфузии раствором Pronase E доли печени набухнут, а дольки станут отчетливо видны через капсулу; затем проведите перфузию 30 миллилитрами раствора коллагеназы P. По завершении перфузии коллагеназой P извлеките печень из мыши, осторожно отделив ее от диафрагмы и окружающих органов, и поместите ее на лед в 70 миллилитрах раствора SC two.
На данном этапе печень теряет свою форму, выглядит атоничной и аморфной. Процедуру переваривания печени мыши следует проводить в стерильных условиях, в ламинарном шкафу.
Используя острые ножницы, разрежьте печень на фрагменты размером примерно 2 × 2 × 2 кубических миллиметра. Затем объедините суспензию из 70 мл SC 2 и фрагменты печени с 50 мл раствора протеазы E и коллагеназы P. Добавьте 1 мл раствора dna 1; подвергните печень воздействию ферментов в течение 20 минут при 37 °C при перемешивании.
После ферментативного переваривания ткани печени звездчатые клетки отделяют от других типов клеток печени методом центрифугирования в градиенте плотности. Для начала этой процедуры профильтруйте клеточную суспензию через клеточные сита с размером пор 70 мкм в шесть пробирок Falcon объемом 50 мл и промойте клетки буфером E2, затем центрифугируйте в течение 10 минут при 600 G и температуре 4 °C. После центрифугирования осторожно аспирируйте 40 мл супернатанта из каждой пробирки.
Затем добавьте по 150 µL раствора DNase I в каждую пробирку и ресуспендируйте клетки. Объедините клеточные суспензии в четыре пробирки Falcon объемом 50 mL и промойте с помощью центрифуги в буфере G-B-S-S-P в течение 10 минут при 600 ×g и 4 °C. Осторожно аспирируйте максимально возможный объем супернатанта, не затрагивая осадок, и добавьте по 150 µL раствора DNase I в каждую пробирку.
Мы ресуспендируем осадки клеток в 10 миллилитрах G-B-S-S-B на пробирку. Объединяем клетки в две фальконовские пробирки объемом 50 миллилитров и добавляем G-B-S-S-B до достижения общего объема 36 миллилитров в каждой пробирке. В каждую пробирку добавляют 14 миллилитров раствора den и тщательно перемешивают.
Далее перенесите 10 миллилитров клеточной суспензии в одну пробирку для градиентного центрифугирования объемом 12 миллилитров, чтобы в итоге получилось 10 пробирок. Осторожно наложите на клеточную суспензию 1,5 миллилитров G-B-S-S-B в каждую пробирку. Центрифугируйте градиенты в течение 15 минут при 1500 Gs и температуре четырех градусов Celsius без перерыва.
После этого гепатоциты осядут в виде осадка на дне пробирки, тогда как звездчатые клетки будут находиться на границе раздела фаз в виде белого кольца. С помощью пятимиллилитровой пипетки осторожно соберите интерфейс, содержащий звездчатые клетки, и перенесите его в пробирку объемом 50 мл. Промойте клетки, добавив G-B-S-S-B, и центрифугируйте в течение 10 минут при 600 Gs и температуре четырех градусов Цельсия.
Отоберите супернатант с помощью пипетки и ресуспендируйте клетки в 20 миллилитрах среды DMEM с добавками. После подсчета клеток перенесите их в колбы для культивирования тканей при концентрации 2 × 10⁴ клеток на квадратный сантиметр; инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO₂. Примерно через два часа после подготовки звездчатые клетки печени должны прикрепиться к поверхности; замените среду, чтобы удалить погибшие клетки и клеточный детрит.
Верните клетки в инкубатор. Типичные результаты выделения звездчатых клеток печени из печени мыши с использованием данного протокола представлены здесь. Клетки на первый и третий день культуры in vitro имеют характерную морфологию звездчатых клеток печени: они имеют астроцитоподобную форму и содержат липидные везикулы.
В некоторых центрах ядерной медицины чистоту изолированных звездчатых клеток печени также можно подтвердить экспрессией глиального фибриллярного кислого белка или GFAP. На этих изображениях представлено репрезентативное иммунофлуоресцентное окрашивание на GFAP, отмеченное красным цветом в звездчатых клетках печени, которые культивировались в течение трех дней после изоляции клеток. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать звездчатые клетки печени из печени нейрона для получения достаточного количества чистых звездчатых клеток.
Важно обеспечить эффективное переваривание при перфузии печени. Наконец, крайне важно определить правильный статус изолированных клеток, оценив морфологию и фенотип клеток печени.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод выделения звездчатых клеток печени из печени мыши. Процесс включает перфузию пищеварительными ферментами с последующим перевариванием in vitro и центрифугированием в градиенте плотности для достижения высокой чистоты выделенных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Исследования печени
- Изоляция стволовых клеток
Теоретические сведения
- Звездчатые клетки печени играют важную роль в физиологии печени.
- Выделение этих клеток необходимо для различных исследовательских целей.
- Традиционные методы могут приводить к получению неочищенных популяций клеток.
- Данный метод направлен на повышение чистоты выделенных клеток.
Цель исследования
- Разработать надежный метод выделения звездчатых клеток печени.
- Повысить чистоту выделенных клеток для использования в исследовательских целях.
- Предоставить подробный протокол для специалистов в данной области.
Используемые методы
- Перфузия печени мыши пищеварительными ферментами.
- Дигестия ткани печени in vitro.
- Центрифугирование в градиенте плотности для разделения клеток.
- Оценка чистоты популяции клеток с помощью методов микроскопии.
Основные результаты
- Была достигнута высокая степень чистоты выделенных звездчатых клеток печени.
- Метод позволяет эффективно отделять их от других типов клеток печени.
- Чистоту клеток можно оценить с помощью световой и иммунофлуоресцентной микроскопии.
- Протокол является воспроизводимым и может быть использован другими исследователями.
Выводы
- Описанный метод эффективен для выделения звездчатых клеток печени.
- Он представляет собой ценный инструмент для исследований печени.
- Будущие исследования могут основываться на данной методике для различных целей применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Выделение звездчатых клеток печени позволяет снизить механистические риски в исследованиях фиброза печени и иммунометаболизма, предоставляя очищенную, релевантную заболеванию систему для валидации мишеней. Данный метод способствует разработке доклинических моделей и стандартизации анализов, повышая прогностическую достоверность при терапевтическом скрининге. Этот рабочий процесс определяет подготовку звездчатых клеток как основополагающий этап для трансляционного поиска биомаркеров и изучения сигнальных путей при разработке лекарственных препаратов для гепатологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать пути фиброза, опосредованные звездчатыми клетками, и функции презентации антигена для проверки целевых гипотез.
- Практическая ценность: обеспечивает получение гомогенной популяции клеток для снижения вариабельности в исследованиях на ранних этапах взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать звездчатые клетки с сохраненной морфологией липидных капель и экспрессией GFAP для получения результатов функционального анализа.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимую подготовку клеточных популяций, пригодных для высокопроизводительного скрининга и профилирования библиотек соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает релевантное моделирование фиброза печени и иммуномодуляции для доклинической валидации заболеваний.
- Практическая ценность: Позволяет масштабировать производство звездчатых клеток для лонгитюдных фармакокинетических и фармакодинамических исследований.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска лекарственных средств, предоставляя валидированные звездчатые клетки для подтверждения мишеней, разработки анализов и снижения механистических рисков до этапа идентификации соединений-лидеров.
- Биологические исследования: способствует уточнению сигнальных путей и функциональной валидации мишеней за счет выделения очищенных звездчатых клеток.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа путем использования стандартизированных суспензий чистых клеток для тестирования соединений.
- Аналитика: позволяет проводить количественную оценку чистоты клеток и состояний их активации с помощью окрашивания на GFAP и визуализации липидных капель.
- Трансляционные исследования: связывают этап открытия с доклиническими исследованиями через модели фиброза и иммунного взаимодействия, опосредованные звездчатыми клетками.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для выделения клеток в рамках программ исследований в области гепатологии для различных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышение прогностической достоверности валидации мишени за счет снижения клеточной гетерогенности в исследованиях звездчатых клеток.
- Операционная ценность: стандартизация и воспроизводимость выделения звездчатых клеток, обеспечивающие согласованность результатов между различными лабораториями.
- Стратегическая ценность: оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки за счет раннего снижения рисков при выборе мишеней для терапии фиброза и иммунологических заболеваний на этапе поиска.
- Влияние на портфель: приоритезация терапевтических средств, направленных на печень, с учетом скорректированных рисков на основе механистических данных о звездчатых клетках.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами перфузии, ферментативного расщепления и центрифугирования в градиенте плотности.
- Зависит от наличия оборудования для перфузии, сеточек для фильтрации клеток, центрифуг и препаратов для создания градиента Nycodenz.
- Необходимо согласование концентраций ферментов, времени расщепления и параметров центрифугирования между всеми исследовательскими группами.
- При адаптации метода следует учитывать видоспецифические скорости перфузии и активность коллагеназы для моделей, отличных от мышиных.
- Практические ограничения включают длительность многоэтапного рабочего процесса и чувствительность к избыточному ферментативному расщеплению, что может повлиять на выход и жизнеспособность клеток.
