Трансмембранного домена олигомеризации склонность определяется Пробирной ToxR

Общая цель данного эксперимента заключается в изучении склонности к связке белков, трансмембранных доменов или Т-МД в естественной мембранной среде. Это достигается за счет экспрессии трансмембранного домена, представляющего интерес у кишечной палочки, в виде химерного белка с мальтоза-связывающим белком для локализации в периплазме и токсе. R в качестве транскрипционного репортера, индуцированная трансмембранным доменом лигаментизация приводит к димеризации токса R и активации транскрипции LXi В качестве второго шага клетки лизируются и обрабатываются ONPG, который гидролизуется бета-галакто, превращаясь в поглощающие свет виды O нитрофолат или ONP.

Следующие уровни ONP количественно оцениваются путем измерения поглощения света на 405 нанометрах. Для определения уровней трансмембранного домена результаты лигаментизации выявляют склонность к связизации трансмембранных доменов на основе репортерного анализа tox R. Основное преимущество этого метода перед существующими биофизическими методами, такими как SDS page или флуоресценция, заключается в том, что поведение трансмембранного домена изучается в естественном фосфолипидном бислое путем экспрессии в кишечной палочке, а не в мембранной миметической системе, такой как сам детергент.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мембранных белков, такие как выяснение ключевых структурных особенностей, участвующих в трансмембранной ассоциации спирали. До начала применения этого протокола из коммерчески синтезированных олигонуклеотидов получают семь плазмид, экспрессирующих необходимый химерный белок, представляющих интерес TDS, фланкированных NHE one и BMH one. Сайты рестрикции после подготовки плазмид аккуратно размораживают fhk 12 компетентных клеток на льду. После размораживания клетки помещают в 15-миллилитровые пробирки с культуральными культурами по 200 нанограммов ДНК каждой плазмы в отдельную пробирку и инкубируют клетки на льду в течение 30 минут.

Затем подвергнуть клетки тепловому шоку в течение 90 секунд при температуре 42 градуса Цельсия с последующей инкубацией на льду в течение двух минут при 800 микролитрах среды SOC и инкубировать образцы при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение одного часа после инкубации инокулировать пять миллилитров LB среды, содержащей хлорамфеникол, и ввести 50 микролитров смеси для трансформации с использованием 15 миллилитровых культуральных пробирок в трех экземплярах для каждого образца. Наконец, инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение 20 часов. Для измерения всей связки TDS определяется активность бета-галактотазы.

Сначала разогрейте считыватель пластин до 28 градусов Цельсия. Используйте запас Z-буфера для приготовления свежих растворов Z-буфера, как описано в письменном протоколе. Перенесите Z-буферный хлороформ из пробирки в резервуар, следя за тем, чтобы прокачивать только верхний водный слой Z-буферного хлороформа.

Поместите 96-луночный планшет на лист бумаги с нарисованной сеткой, чтобы обеспечить точное пипетирование, переведите 100 микролитров Z-буферного хлороформа в каждую лунку 96-луночного планшета, а затем по пять микролитров каждой культуры в четверке. Дублируйте опустошите культуру из четырех лунок, которые будут служить заготовками. Измерьте наружный диаметр 5 95 пластины, чтобы определить плотность клеток.

Добавьте 50 микролитров Z-буфера SDS во все лунки пластины. Затем встряхните планшет в планшетном ридере в течение 10 минут, чтобы клетки после лизиса клеток получили 50 микролитров ZPA для ONPG во все лунки. Верните пластину в считыватель пластин и измеряйте внешний диаметр 4 0 5 каждые 30 секунд в течение 20 минут.

Определите уровень активности бета-лакто-сазы с помощью вычисления единиц Миллера, нормализованных к пустому столбу. Вестерн-блоттинг проводится для проверки эквивалентной экспрессии белка между конструкциями. Сначала смешайте 50 микролитров тройных культур, а затем центрифугируйте образцы с помощью микроцентрифуги.

Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования и резонатора. Суспендируйте остаточную гранулу в двух х загрузках образца в буфер, загрузите по 7,5 микролитров каждого образца на стандартный 8%-ный гель и проведите электрофорез при напряжении 125 вольт в течение одного часа и пяти минут после переноса. Инкубация мембраны с конъюгированным антителом против M-V-P-H-R-P для визуализации химерного белка наблюдается при концентрации примерно 70 килодальтон, а некоторые продукты распада иногда наблюдаются при конъюнктуре около 48 килодальтон

Эндогенный ПМК также наблюдается на уровне 45 килодальтонн. Для оценки правильного встраивания в мембрану химерной конструкции TMD используется клеточная линия PD 28 с дефицитом мальтозосвязывающего белка при выращивании в минимальной среде с мальтозой в качестве единственного источника углерода, могут выращивать только клетки, экспрессирующие мембранный интегральный продукт экспрессии с мальтоза-связывающим белком, правильно расположенным в периплазме. Трансформируйте клетки PD 28, как описано для клеток fhk 12, и инокулируйте два миллилитра среды LB.

Выращивайте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием при 300 оборотах в минуту в течение ночи после инкубации. Гранулируют клетки методом центрифугирования и промывают суспензией Resus в двух миллилитрах PBS и щадящим пипетированием с большим наконечником. После гранулирования клетки снова промывают PBS во второй раз, затем выполняют окончательное центрифугирование и резус-суспензию в одном миллилитре PBS.

Используйте 25 микролитров ресуспендированных клеток для инокуляции пяти миллилитров минимальной среды. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в 15 часов. Перелейте 200 микролитров каждого образца в 96-луночный планшет и снимите показания наружного диаметра 5 9 5 с помощью планшетного ридера.

Повторяйте этот процесс каждые два часа до 25 часов. С помощью транскрипционного репортерного анализа был проанализирован общий склонность к лигаментизации отдельных трансмембранных доменов из многослойного мембранного интегрального белка латентного мембранного белка номер один. Трансмембранный домен 5 демонстрирует сильную склонность к повышению лиги, что демонстрируется высокими единицами Миллера, что сопоставимо с хорошо установленной димеризующей последовательностью положительного контроля GPAA.

Вредная мутация в трансмембранном домене 5 D one 50 A снижает способность последовательности ко всем лигам повышаться LMP one, TM one существенно не все лиги повышаются и проявляет очень низкий сигнал единицы Миллера чуть выше сигнала для холостых, которые являются нетрансформированными FHK 12 клетками. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как определить, обладает ли исследуемая трансмембранная спираль способностью образовывать комплексы более высокого порядка в естественной мембранной среде При попытке выполнения этой процедуры важно очень осторожно вводить пипетку в 96-луночный планшет, чтобы избежать больших ошибок и убедиться, что пузырьки воздуха не вносятся.