Методы оценки бета опосредованная гибель клеток от цитотоксических Т-лимфоцитов

Сахарный диабет 1 типа представляет собой аутоиммунное заболевание, при котором инсулин-секретирующие бета-клетки поджелудочной железы разрушаются аутореактивными T-клетками. Понимание задействованных механизмов позволит найти способы создания эффективного метода лечения этого заболевания. В данном материале продемонстрированы два метода наблюдения за специфическим разрушением бета-клеток поджелудочной железы, опосредованным cd8-положительными T-клетками in vitro: анализ клеточной медиаторной лимфоцитотоксичности (CML) на основе хрома 51 и визуальный анализ CML.

Для проведения анализа CML сначала подготавливают CD8-положительные Т-эффекторные клетки из селезёнок мышей. Таргетные бета-клетки Knit 1 или Knit 4 метят хромом 51 и культивируют совместно с эффекторными клетками. При гибели таргетных бета-клеток происходит высвобождение хрома 51. Затем собирают супернатанты и лизаты клеток, после чего с помощью гамма-счетчика измеряют уровни радиоактивности, которые указывают на степень гибели клеток. Для проведения визуального анализа CML таргетные бета-клетки Knit 1 и Knit 4 метят красителем митохондриального потенциала TM RM, а эффекторные клетки — PicoGreen.

Клетки объединяют и проводят визуализацию живых клеток для изучения скорости гибели клеток, о которой свидетельствует падение митохондриального мембранного потенциала. Основным преимуществом данного метода перед традиционными анализами, такими как анализ высвобождения хрома, является возможность наблюдать гибель бета-клеток в режиме реального времени. Дополнительные преимущества включают возможность определить, зависит ли гибель бета-клеток, опосредованная CD8 T-клетками, от непосредственного контакта, а также возможность расширения данного анализа с использованием флуоресцентных индикаторов для картирования путей гибели бета-клеток.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы о патогенезе любого заболевания, в котором участвуют цитотоксические Т-клетки. Значимость этой методики распространяется на терапию и, возможно, диагностику, поскольку функция митохондрий имеет решающее значение как для выживания, так и для физиологии бета-клеток. Цзин Чэнь и я продемонстрируем эту процедуру.

Целевыми клетками, используемыми в данной демонстрации, являются линии бета-клеток мыши knit one и knit four; в качестве отрицательного контроля используются клетки линии человеческих лимфоцитов Jurkat CD3+, которые не распознают и не уничтожают бета-клетки мыши. В качестве эффекторных клеток здесь используются аутореактивные CD8+ T-клетки, полученные из селезенки мышей NOD AI four alpha beta F1 в возрасте трех-четырех недель. Для получения клеток сначала поместите селезенки в стеклянный гомогенизатор Даунса объемом 7 мл, содержащий 5 мл ледяного HBSS. Гомогенизируйте селезенки с помощью гомогенизатора Даунса, затем перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку и центрифугируйте при 250 ×g в течение пяти минут. После центрифугирования удалите супернатант, затем для удаления эритроцитов ресуспендируйте осадок в 5 мл гипотонического раствора на одну селезенку. Инкубируйте в течение пяти минут на льду.

После инкубации дважды промойте осадок клеток 10 миллилитрами ледяного HBSS с помощью центрифугирования. После каждой промывки ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах ледяного HBSS. Затем с помощью гемоцитометра подсчитайте количество клеток.

Снова центрифугируйте, затем ресуспендируйте клетки в дополненной среде RPMI 1640 до плотности 5 × 10⁶ клеток/мл; высейте клетки с плотностью 5 × 10⁶/мл в флакон T 75. Наконец, для активации клеток добавьте в флакон AI4 myope и IL-2 до конечных концентраций 0,1 µM и 25 U/мл соответственно; инкубируйте флакон в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C в течение трех дней. Теперь активированные клетки можно использовать либо для CML-анализа на основе ACROMIUM 51, либо для визуального CML-анализа.

В данном анализе клеточно-опосредованной лимфоцитотоксичности (CML) высвобождение хрома-51 из клеток-мишеней используется в качестве индикатора гибели бета-клеток, опосредованной CD8. Чтобы пометить бета-клетки-мишени MIN6 или MIN4 хромом-51, начните с их посева с плотностью 5×10⁴ клеток на лунку в 96-луночном планшете в 200 µL дополненной среды DMEM; инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 часов. На следующий день разведите хром-51 в дополненной DMEM до концентрации 1 мкКи на 20 µL.

Затем добавьте 20 µL разбавленного хрома 51 в каждую лунку с целевыми бета-клетками, чтобы достичь активности 1 µCi на лунку. Поместите планшет в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C с 5% CO2 и инкубируйте в течение трех часов. После инкубации аспирируйте среду и трижды промойте клетки свежей культуральной средой.

Затем добавьте среду к активированным CD8-положительным эффекторным клеткам так, чтобы конечный объем, добавляемый в каждую лунку, составил 200 microliters. Объедините эффекторные клетки с культурами таргетных бета-клеток в выбранных соотношениях E:T; для подготовки контролей спонтанного лизиса используются соотношения 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 и 0.25:1. В шесть лунок с таргетными бета-клетками добавьте свежую среду.

Затем поместите планшет в инкубатор и культивируйте эффекторные и таргетные клетки совместно в течение 16 часов. На следующий день с помощью многоканального дозатора перенесите супернатант в шесть стеклянных пробирок диаметром 50 мм. Затем для лизиса клеток добавьте в планшет 100 µL 2% SDS и осторожно перемешайте содержимое, несколько раз пропипетировав жидкость вверх и вниз.

Перенесите клеточный лизат в новый набор из шести стеклянных пробирок объемом 50 мм. Затем, чтобы обеспечить полный сбор клеточного лизата, добавьте по 100 µL стерильной воды в каждую лунку, перемешайте содержимое путем пипетирования вверх-вниз и перенесите в пробирки с клеточным лизатом для определения степени разрушения бета-клеток. После проведения подсчета измерьте радиоактивность в супернатанте и лизате с помощью гамма-счетчика.

Определите специфический лизис, вычтя процент отсчетов в супернатантах контрольной группы со спонтанным лизисом из процента отсчетов в экспериментальных супернатантах, как показано в данном уравнении. Для изучения гибели бета-клеток, опосредованной Т-клетками, в режиме реального времени мониторинг митохондриального мембранного потенциала проводится с помощью визуализации живых клеток в кокультурах мишеней и эффекторов.

Для подготовки к микроскопии высейте целевые бета-клетки на модифицированное и стерилизованное восьмилуночное камерное покровное стекло в концентрации 5 × 10⁴ клеток на лунку. Поместите предметные стекла в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 и дайте клеткам расти в течение 48 часов. В день эксперимента добавьте краситель для определения потенциала митохондриальной мембраны тетраэтилбромидметилэфир (TMRM) в концентрации 25 нМ в дополненной среде DMEM без фенолового красного и инкубируйте в течение 30 минут.

После окрашивания клеток TMRM замените среду на свежую среду, содержащую 5 nM TMRM, для поддержания равновесного распределения красителя. Затем подсчитайте количество активированных эффекторных T-клеток или контрольных Jurkat-клеток с помощью гемоцитометра и ресуспендируйте клетки в дополненной среде DMEM без фенолового красного в конических пробирках объемом 15 мл до соответствующей концентрации. Далее добавьте PicoGreen к активированным эффекторным клеткам или контрольным Jurkat-клеткам до конечной концентрации 1 µL/mL.

Оберните пробирку алюминиевой фольгой для защиты от света, затем после инкубации выдержите пять минут при комнатной температуре. Промойте клетки трижды, добавляя DMEM без фенолового красного, с кратковременным перемешиванием и центрифугированием при 250 GS в течение пяти минут. Для сбора клеток для визуализации поместите предметное стекло с камерой на предметный столик конфокального микроскопа, оснащенного моторизованным столиком и увлажняющей камерой для визуализации живых клеток при 37 °C и 5% CO2.

Добавьте активированные эффекторные клетки, окрашенные PicoGreen, в камеры в соотношении эффекторов к мишеням, которое будет оцениваться в данном эксперименте. Соотношение E:T для визуализации составит 50:1; настройте программное обеспечение для визуализации так, чтобы каждые три минуты собирались изображения в четырех лунках по три локации в каждой, по 300 кадров на локацию, используя соответствующие наборы фильтров для возбуждения TMRM и PicoGreen. После сбора всех изображений их необходимо конвертировать для последующей публикации.

Fiji и Image J используются с плагином Bio-Formats от loci. Более подробную информацию о конвертации видео можно найти в сопроводительном текстовом описании. Анализ клеточной лимфоцитотоксичности (ЦЛТ) был проведен с использованием хрома 51, как описано в данном видео.

Как показано здесь, процент специфического лизиса на оси Y увеличивается по мере увеличения соотношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням на оси X. Для оценки гибели клеток методом визуализации живых клеток линия мышиных бета-клеток KNIT1 была окрашена красителем мембранного потенциала митохондрий TMRM (показан красным), а активированные аутореактивные I4 CD8-положительные T-клетки были окрашены PicoGreen (показаны зеленым); два типа клеток культивировались совместно при соотношении E:T 50:1, как видно здесь. Мембранный потенциал митохондрий KNIT1 постепенно снижался в течение 400 минут, но только в кластерах, взаимодействующих с зелеными T-клетками I4. В качестве контрольного эксперимента окрашенные клетки KNIT1 культивировали с окрашенными PicoGreen MHC-несовместимыми человеческими T-клетками Jurkat, как показано здесь.

Клетки knit one были способны поддерживать потенциал митохондриальной мембраны на протяжении 400 минут. Клетки circuit не взаимодействовали с кластерами knit one и, следовательно, не вызывали гибель клеток. После освоения.

Данная методика занимает примерно пять дней, включая подготовку клеток. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как изменяется мембранный потенциал бета-клеток при воздействии аутореактивных Т-лимфоцитов. Не забывайте, что работа с радиоизотопами может быть опасной, поэтому перед выполнением данной процедуры необходимо пройти соответствующее обучение и принять все меры предосторожности.