Генерация Multivirus конкретным Т-клеток по предотвращению / лечения вирусных инфекций после аллогенной трансплантации стволовых клеток

Общая цель следующей процедуры заключается в быстром получении вирус-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), полученных от донора, которые пригодны для адаптивного переноса реципиентам аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Это достигается путем предварительной нуклефекции дендритных клеток (ДК) плазмидами, кодирующими вирусные антигены, для подготовки клеток к презентации антигена. На втором этапе нуклефецированные ДК используются для стимуляции антиген-специфических Т-клеток, которые затем экспансируют в присутствии IL-4 и IL-7 в газопроницаемом культуральном устройстве, называемом GASPAR.

Затем, после семи дней культивирования, клетки пересевают и пересаживают, а среду обновляют для поддержания максимальной экспансии CTL in vitro. Наконец, на 12-й день клетки собирают, тестируют на чистоту, активность и безопасность, после чего криоконсервируют для последующего клинического применения. В конечном итоге могут быть получены линии CTL с мультивирусной специфичностью и минимальной аллореактивностью, что подтверждается результатами внутриклеточного окрашивания на цитокины, продукцией интерферона гамма и цитотоксичностью.

Создание многовирус-специфических линий цитотоксических Т-клеток является трудоемким и длительным процессом. Он требует использования трансформированных вирусом Эпштейна-Барр B-клеточных линий и аденовирусных векторов, а сама процедура занимает около трех месяцев. Наш новый метод не предполагает использования вирусных векторов.

Клетки растут в культуре экспоненциально с минимальными потерями, поэтому процедура является быстрой и экономически эффективной. Эту процедуру демонстрирует Эврика Гердеман, клинический сотрудник лаборатории. Соберите дендритные клетки (ДК), полученные из моноцитов, которые были выращены в среде Cellgenic с добавлением IL-4 и G-M-CSF, а затем созревали в течение 24 часов в присутствии цитокинов созревания, аккуратно ресуспендировав их с помощью трехмиллилитровой переносной пипетки. Используйте трипановый синий для подсчета ДК, затем перенесите их в три 15-миллилитровые пробирки, чтобы в каждой пробирке было не менее 0.5 × 10⁶ и не более 2 × 10⁶ клеток.

Затем центрифугируйте DCS в течение 10 минут при 200 ×g. В это время приготовьте 6 мл среды Cell Genix, дополненной тем же коктейлем цитокинов для созревания DC, что и ранее, и распределите по 2 мл в три лунки 12-луночного планшета для культивирования тканей; неиспользуемые лунки заполните 2 мл стерильной воды. Перенесите планшет в инкубатор при 37 °C с 5% CO2 для предварительного прогрева.

После завершения центрифугирования клеток аспирируйте супернатанты и добавьте в каждую пробирку соответствующие плазмиды ДНК до конечной концентрации 5 µg ДНК на пробирку. В данном случае в пробирку №1 добавляется плазмида, кодирующая IE1 pp65, в пробирку №2 — hp529 (пентон), а в пробирку №3 — EBNA1 LMP2 BZLF1. Ресуспендируйте DCS и ДНК в 100 µL раствора для ядерной трансфекции.

Тщательно перемешайте и перенесите смесь в кюветы для нуклеофекции Nucleocuvette. Поместите кюветы в аппарат Nucleofector 4D. Выберите программу CB 150 и нажмите кнопку пуска; сразу после нуклеофекции извлеките кюветы.

Добавьте 500 µL предварительно подогретой среды для созревания Cellgenic DC в каждую пробирку, перемешайте клетки, осторожно пропипетируя содержимое вверх-вниз два-три раза, и перенесите трансфицированные DCs в подготовленный 12-луночный планшет, содержащий оставшиеся 1,5 мл предварительно подогретой среды для созревания DC. Перенесите планшет в инкубатор еще на 12–18 часов, затем соберите, подсчитайте и облучите трансфицированные DCs. Промойте клетки один раз 10 мл среды CTL, а затем ресуспендируйте их из расчета 3 × 10⁵ DCs на 1 мл среды. Объедините минимум 7,5 × 10⁵ (или 2,5 мл) и максимум 15 × 10⁵ (или 5 мл) DCs из всех трех трансфекций и перенесите объединенные плазмидно-трансфицированные DC в устройство G Rex.

Затем поместите устройство в инкубатор для подготовки клеток-респондеров. Используйте нефракционированные мононуклеарные клетки, оставшиеся после селекции DC. Перенесите респондеры в предварительно нагретый культуральный раствор.

Промойте их один раз средой CTL. Ресуспендируйте клетки в среде CTL. Подсчитайте количество клеток и доведите их концентрацию до 2 × 10⁶ клеток на мл.

Возьмите 15 × 10⁶ клеток или 7,5 мл и добавьте цитокины IL-4 и IL-7. Перенесите 7,5 мл PBMC в G REX и долейте в биореактор среду для CTL до общего объема 30 мл. В завершение поместите G REX в инкубатор на шесть-семь дней; на шестой-седьмой день аспирируйте 10 мл среды.

Затем перемешайте оставшиеся 20 milliliters среды с помощью 10 milliliter пипетки. Если количество клеток составляет менее 50 × 10⁶, используйте трипан синий для подсчета клеток. Обновите культуру, добавив свежую среду и цитокины.

Если количество клеток превышает 50 × 10⁶, удалите 10 мл клеточной суспензии, перенесите клетки в новый G rex, затем добавьте в оба G rex свежую среду CTL и цитокины; культивируйте клетки еще четыре-шесть дней для достижения достаточного количества, после чего соберите и подсчитайте клетки. Затем криоконсервируйте все клетки, не использованные для фенотипического или функционального анализа, для последующего использования. Репрезентативные результаты показывают, что мультицитонинные ДНК-плазмиды индуцируют мультивирус-специфические Т-клетки, что подтверждено методом ELISPOT на интерферон-гамма, при этом частота реактивных клеток выше, чем в линиях, созданных с использованием обычных плазмид PHU, экспрессирующих те же антигены.

Оптимальное соотношение DC к PBMC имеет важное значение для эффективной стимуляции T-клеток, как показано на данном рисунке, где соотношение 1:50 приводит к субоптимальной реактивации по сравнению с соотношением стимулятора к респонденту 1:20. Культивирование CTL в системе G rex, представленное на этом рисунке, обеспечивает более интенсивную экспансию T-клеток по сравнению с традиционными 24-луночными планшетами. Добавление IL-4 и IL-7 в культуры расширяет репертуар и специфичность экспансированных клеток, что показано здесь: оценивалась частота T-клеток, реактивных к NLV-пептиду, производному от CMV PP65 и ограниченному HLA-A2, в культурах, созданных в присутствии или отсутствии IL-4 и/или IL-7. На этом рисунке представлен репрезентативный образец фенотипа быстро экспансированных мультивирусных CTL, которые являются поликлональными и содержат смесь CD4-положительных и CD8-положительных T-клеток, большинство из которых экспрессируют маркеры памяти CD45RO и CD62L. Экспансированные CTL специфичны ко всем стимулирующим антигенам и полифункциональны, что подтверждается данными внутриклеточного окрашивания на цитокины для обнаружения продукции интерферона гамма и TNF-alpha после стимуляции антигеном, а также результатами анализа высвобождения хрома.

Экспандированные CTL способны специфически уничтожать вирусные мишени, но не проявляют неспецифической активности в отношении не вирусных мишеней с несовпадением HLA, что является критически важным аспектом безопасности. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как быстро создавать клеточные линии цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к нескольким вирусам, которые совместимы с требованиями GMP и пригодны для адаптивного переноса пациентам с вирусными заболеваниями. Упрощение данной процедуры должно способствовать ее внедрению за пределами специализированных производственных центров и позволить сделать этот метод стандартом лечения пациентов с иммунодефицитом, которые крайне восприимчивы к вирусным заболеваниям.