Бесклеточной системе Пробирной Оценка нейтрализующей способности ГМ-КСФ антител с использованием рекомбинантных растворимых ГМ-КСФ рецептор
27 июня 2011 г.
Мы разработали бесклеточной связывание с рецепторами анализа для оценки связывания гранулоцитов и макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF) с рецепторами. Это позволяет нам оценить конкурентного ингибирования биотинилированного GM-CSF связывания с растворимыми GM-CSF рецепторов альфа-ГМ-КСФ аутоантител с отличной воспроизводимости.
Общая цель данного эксперимента — разработать бесклеточный анализ для количественной оценки нейтрализующей способности аутоантител к G-M-C-S-F. Сначала мы получаем трансгенных шелкопрядов. Вводим ген человеческого SGMR alpha для экспрессии рекомбинантного SGMR alpha, после чего переходим к мечению рекомбинантного G-M-C-S-F человека с помощью bioTE.
Далее мы оцениваем корреляцию между бесклеточной системой и стандартным биоанализом, изучая ингибирование связывания G-M-C-S-F с SGMR alpha аутоантителами к G-M-C-S-F. Полученные результаты демонстрируют значимую корреляцию между ингибированием роста в биоанализе и ингибированием связывания в бесклеточной системе при использовании фракций IgG сыворотки и очищенных аутоантител к G-M-C-S-F. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими методами, такими как биоанализ TF one, является то, что эта система обеспечивает высокую аналитическую точность и хорошую воспроизводимость при измерении нейтрализующей способности аутоантител к GM CSF.
Поскольку аутоантитела к GM CSF вызывают аутоиммунный первичный общий неблагоприятный прогноз, применение данного метода распространяется на диагностику. Его также можно использовать в анализах конкурентного связывания с применением рекомбинантных цитокиновых рецепторов, таких как рецепторы к BEGF и TNFA. Демонстрация процедуры будет представлена докторантом из моей лаборатории, который первым разработал эту систему, не требующую контроля pH.
В данном видео показан шелкопряд, используемый для получения рекомбинантного SGMR alpha. Первым этапом является амплификация кДНК для SGMR Alpha из библиотеки кДНК плаценты человека с помощью полимеразной цепной реакции. Затем проводится вторая ПЦР для добавления к 5'-концу полученного ПЦР-ампликона 5'-нетранслируемой последовательности (UTR) длиной 50 оснований из полиэдрона вируса baculovirus.
Для маркировки R RRGs его тегом с 3'-конца клонируют амплифицированный ПЦР-продукт R в плазмиду P MSG one one mg. Конструкцию PS GMR slash M1 one mg совместно с хелперным вектором PHA three pig ко-инъецируют в яйца шелкопряда линии PNDW one. Вылупившихся личинок поколения G0 выращивают до стадии мотылька при 25 °C. Затем эмбрионы поколения G1 скринируют либо путем скрещивания сибсов, либо с линией PNDW one, определяя экспрессию MG FP в глазах, что указывает на наличие трансгенных шелкопрядов.
Для получения рекомбинантного белка SGMR alpha из коконов трансгенных шелкопрядов ген SGMR alpha экстрагируют фосфатным буфером, содержащим 500 millimolar NaCl, при перемешивании в течение 24 часов при температуре 4 °C. Образцы центрифугируют при 20 000 ×g в течение 15 минут. Для удаления преципитатов супернатант наносят на колонку с никель-аффинным сорбентом.
Промойте колонку и элюируйте белки с использованием линейного градиента от 10 millimolar до 250 millimolar. Объедините фракции, содержащие очищенный SGMR alpha, и проведите диализ против фосфатно-солевого буферного раствора. Первичный диализ образцов выполняйте с использованием PBS.
Чтобы удалить сорбитол из препарата G-M-C-S-F, добавьте один миллилитр 20 мМ холодного раствора мета-натрия и инкубируйте образец в течение 30 минут на льду в темноте. Затем добавьте глицерин до конечной концентрации 15 мМ и проведите диализ против 100 мМ натрий-ацетатного буфера. Далее добавьте в раствор биотин-азид до конечной концентрации пять мМ и перемешивайте в течение двух часов при комнатной температуре.
Наконец, удалите нереакционноспособный материал путем диализа против PBS, затем покройте микропланшет 50 µL моноклональных антител к polyhis, выдержав в течение ночи при 4 °C. Промойте пять раз PBST. Затем добавьте 100 µL блокирующего раствора и инкубируйте в течение трех часов при 4 °C.
Снова промойте пять раз раствором PBST. Добавьте 50 µL SGMR alpha в блокирующий раствор и инкубируйте в течение ночи при 4 °C после пяти промывок раствором PBST. Добавьте 25 µL образцов, содержащих аутоантитела к G-M-C-S-F, а затем 25 µL биотинилированного G-M-C-S-F и инкубируйте в течение одного часа при 4 °C.
Для формирования комплекса SGMR alpha G-M-C-S-F продолжайте промывание пять раз раствором PBST, затем добавьте 50 µL стрептавидина, конъюгированного с щелочной фосфатазой, и инкубируйте в течение одного часа при 4 °C для обнаружения биотинилированного G-M-C-S-F, связавшегося с SGMR alpha. Промойте пять раз раствором PBST, добавьте к раствору 50 µL хемилюминесцентного субстрата, инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре и определите интенсивность хемилюминесценции с помощью планшетного ридера. При анализе методом SDS-PAGE рекомбинантный SDMR alpha, полученный из шелкопряда, присутствует как в мономерной, так и в димерной формах в невосстанавливающих условиях, но только в мономерной форме в восстанавливающих условиях.
Данная рекомбинантная смесь мономеров и связанных дисульфидными мостиками димеров SGMR alpha функциональна в анализе конкурентного связывания. Комплекс biotinylated G-M-C-S-F с SGMR alpha проявляет специфичность, так как он может быть диссоциирован при добавлении различных концентраций нейтрализующих антител, но не ненейтрализующих антител. Кроме того, увеличение концентрации нейтрализующих антител к G-M-C-S-F положительно коррелирует с увеличением процента ингибирования связывания дозозависимым образом.
Как и ожидалось, ингибирование связывания ненейтрализующими антителами к G-M-C-S-F не зависело от дозы. Данная бесклеточная система демонстрирует тесную корреляцию между ингибированием связывания G-M-C-S-F с SGMR альфа аутоантителами к G-M-C-S-F с рассчитанными значениями r равным 0,988 и значением P равным 0,002. Ингибирование связывания аутоантителами к G-M-C-S-F возрастало дозозависимым образом.
Аналогично, ингибирование связывания значимо коррелировало с ингибированием роста импорта. Данный анализ полезен при исследовании фракций IgG сыворотки пациентов с аутоиммунным PAP, что продемонстрировано здесь взаимосвязью между IC 50 процента ингибирования связывания и процентом ингибирования роста фракциями IgG сыворотки. Кроме того, коэффициент вариации между экспериментами указывает на преимущество бесклеточной системы по сравнению с биоанализом ингибирования роста.
После освоения этот бесклеточный анализ связывания лиганда с GM GSF-рецептором может быть успешно выполнен за 38 часов. Важно помнить о соблюдении условий реакции, температуры и времени инкубации. Данный метод открыл исследователям в области скрининга биологической активности новых антитело-препаратов путь к замене традиционных биоанализов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен бесклеточный анализ связывания рецепторов, предназначенный для количественной оценки нейтрализующей способности аутоантител к GM-CSF. Анализ демонстрирует отличную воспроизводимость и позволяет оценить конкурентное ингибирование связывания GM-CSF с его рецептором.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Клеточная биология
Теоретическая часть
- Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) играет важную роль в иммунном ответе.
- Автоантитела к GM-CSF могут влиять на его связывание с рецепторами.
- Существующие биоанализы могут обладать недостаточной воспроизводимостью и чувствительностью.
- Бесклеточная система может обеспечить более надежное измерение взаимодействий при связывании.
Цель исследования
- Разработать бесклеточный анализ для количественного определения нейтрализации аутоантител к GM-CSF.
- Сравнить бесклеточный анализ с традиционными биоанализами.
- Оценить корреляцию между ингибированием связывания и ингибированием роста.
Используемые методы
- Производство рекомбинантного SGMR alpha с использованием трансгенных шелкопрядов.
- Маркировка GM-CSF с помощью bioTE для анализа связывания.
- Оценка ингибирования связывания аутоантителами к GM-CSF.
- Сравнение результатов с традиционными биоанализами.
Основные результаты
- Была отмечена значимая корреляция между ингибированием связывания и ингибированием роста.
- Бесклеточный анализ продемонстрировал высокую воспроизводимость.
- Фракции IgG сыворотки эффективно ингибировали связывание GM-CSF.
- Новый метод анализа превзошел существующие методы по качеству анализа.
Выводы
- Бесклеточный анализ связывания рецепторов является надежным инструментом для изучения аутоантител к GM-CSF.
- Данный метод обеспечивает более точную оценку нейтрализующей способности.
- В будущих исследованиях этот метод может быть использован для дальнейшего изучения иммунологических аспектов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Этот бесклеточный анализ представляет собой воспроизводимый количественный метод измерения нейтрализующей способности аутоантител к GM-CSF, позволяющий преодолеть ограничения традиционных клеточных биоанализов. Он способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в исследованиях аутоиммунных заболеваний, предоставляя надежные данные об ингибировании связывания, которые коррелируют с функциональными результатами. Данный анализ обеспечивает прогностическую достоверность при оценке биомаркеров для стратификации пациентов и мониторинга терапевтического ответа при альвеолярном протеинозе легких и связанных с ним иммуноопосредованных нарушениях.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения нейтрализации биоактивности GM-CSF под воздействием аутоантител.
- Практическая ценность: предоставляет бесклеточную систему, которая снижает вариабельность, связанную с поддержанием культур живых клеток в различных лабораториях.
- Прогностическая ценность: подтверждает достоверность мишени за счет дозозависимой корреляции между концентрацией аутоантител и ингибированием связывания с рецептором.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает количественную оценку ингибирования связывания, подходящую для высокопроизводительного скрининга библиотек антител.
- Практическая ценность: Использует рекомбинантный растворимый рецептор альфа GM-CSF, полученный из трансгенных шелкопрядов, что обеспечивает масштабируемое и стабильное производство реагентов.
- Готовность анализа: Совместимость со стандартными форматами микропланшетов и химилюминесцентной детекцией облегчает интеграцию в существующие платформы скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между этапами открытия и доклинической валидации путем корреляции ингибирования связывания in vitro с ингибированием роста клеток TF-1 ex vivo.
- Соответствие биомаркеров: поддерживает оценку фракций IgG в сыворотке крови пациентов в качестве косвенного показателя тяжести заболевания при аутоиммунном альвеолярном протеинозе легких.
- Развитие с учетом рисков: позволяет принимать решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе воспроизводимых измерений нейтрализующей способности, а не только концентрации антител.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в цикл разработки от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, предлагая надежный ортогональный метод подтверждения функциональной активности антител перед переходом к клеточным моделям или исследованиям in vivo.
- Фундаментальная биология: Позволяет проверить гипотезы, измеряя степень нарушения взаимодействия аутоантител с рецептором GM-CSF, что является ключевым механизмом патогенеза аутоиммунных заболеваний.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированную оценку ингибирования связывания антител с высокой воспроизводимостью, что снижает количество ложноположительных результатов при поиске перспективных кандидатов.
- Аналитика: Позволяет строить кривые зависимости «доза-эффект» и рассчитывать значения IC50 на основе данных об ингибировании связывания, что обеспечивает количественное сравнение образцов антител или терапевтических кандидатов.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклиническими работами через установленную корреляцию с ингибированием роста клеток TF-1, что способствует снижению рисков при изучении механизмов действия.
- Применение в масштабах предприятия: Платформа по производству рекомбинантных рецепторов может быть адаптирована для других пар «цитокин-рецептор», что способствует стандартизации процессов между различными проектами.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов, позволяя сосредоточиться на функциональной нейтрализующей способности, а не на общей концентрации антител.
- Практическая ценность: Устраняет необходимость поддержания клеточных культур, что снижает сложность анализа и улучшает воспроизводимость результатов между разными лабораториями.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, обеспечивая раннее снижение рисков для кандидатов-антител на основе их активности, обусловленной механизмом действия.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию терапевтических кандидатов с поправкой на риск на основе биомаркерных данных, имеющих механистическое обоснование.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области продукции, очистки и маркировки рекомбинантных белков, в том числе методов биотинилирования.
- Зависит от доступа к трансгенным системам шелкопряда или альтернативным платформам экспрессии для получения растворимых рецепторов.
- Необходимы стандартизированные условия блокировки и промывки для минимизации фонового сигнала в анализах на микротитрационных планшетах.
- Требуется калибровка с использованием контрольных образцов аутоантител для установления порогов ингибирования связывания при определении положительных и отрицательных результатов.
- Ограничено форматами растворимых рецепторов; может не учитывать мембранно-зависимую передачу сигналов или эффекты авидности, присутствующие в клеточном контексте.
